铁蛋白免疫电镜操作步骤
互联网
2001
（一） 原理
免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体 ，再以铁蛋白抗体 与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。
（二）材料与试剂
1. 马脾铁蛋白
2. 硫酸铵
3. 硫酸镉
4. 双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante ，XC)以0. 3 mol/L p h9. 5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4 ℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。
5. 0.3 mol/L ph 9.5硼盐酸缓冲液
6. 0.1 mol/L硫酸铵液
7. 0.05 mol/L ph7.4 PBS液
（三）操作方法
⑴ 配制2%硫酸铵液，并以1 mol/L的NaOH或 hCl调p h值，正好为5. 85。取1 g铁蛋白溶于100 ml的2%硫酸铵液
1. 铁蛋白的提取
⑴ 配制2%硫酸铵液，并以1 mol/L的NaOH或 hCl调ph值，正好为5.85。取1 g铁蛋白溶于100 ml的2%硫酸铵液中。
⑵ 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4 ℃过夜。
⑶ 1 500 g离心(4 ℃)2 h，去上清。仍加2%硫酸铵至100 ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。
⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。
⑸ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。
⑹ 以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。
⑺ 重复步骤⑹一次。
⑻ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24 h后,以0. 05 mol/L p h 7. 5PBS透析24 h。
⑼ 100 000 r/ min离心2 h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4 ℃过夜。
⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45 μ)过滤，使铁蛋白含量为65 mg/ ml～75 mg/ ml，分装，4 ℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。
2. 铁蛋白－抗体交联法
⑴ 以0. 3 mol/L ph 9. 5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20 mg/ ml～25 mg/ ml。
⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45 min，离心去沉淀。
⑶ 以0. 3 mol/L ph 9. 5硼酸盐缓冲液将提纯l g配成5 mg/ ml，以1︰4的比例(V/V)加入I g与铁蛋白－XC液，4 ℃搅拌48 h。
⑷ 以0. 1 mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0. 05 mol/L ph 7. 5 PBS透析，使ph值恢复到生理水平。
⑸ 超速离心 以1. 00×105 g离心5 h，去上清，沉淀以0. 05 mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的I g。
⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。
3. 铁蛋白－抗体结合物处理标本
（1）将标本以5%福尔马林p h 7. 2(4 ℃)PBS液固定40 min～60 min。
（2）用冷的PBS液洗涤，离心。
（3）如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20 min，不时振荡,
（4）以冷PBS液洗涤三次，离心。
（5）沉淀以2. 5%戊二醛固定20 min，以PBS洗涤。
（6）再以锇酸固定，脱水包埋。
也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下：
⑴ 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4 ℃)。
⑵ PBS液洗涤离心。
⑶ 以0. 5 ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（p h7. 5）中固定3 h。
⑷ 取出，切成小块，以PBS液洗涤。
⑸ 置干燥器中以硅胶干燥。
⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。
⑺ 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。
⑻ 5 min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。
⑼ 凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。
⑽ 水洗、晾干、电镜观察。
免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体 ，再以铁蛋白抗体 与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。
（二）材料与试剂
1. 马脾铁蛋白
2. 硫酸铵
3. 硫酸镉
4. 双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante ，XC)以0. 3 mol/L p h9. 5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4 ℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。
5. 0.3 mol/L ph 9.5硼盐酸缓冲液
6. 0.1 mol/L硫酸铵液
7. 0.05 mol/L ph7.4 PBS液
（三）操作方法
⑴ 配制2%硫酸铵液，并以1 mol/L的NaOH或 hCl调p h值，正好为5. 85。取1 g铁蛋白溶于100 ml的2%硫酸铵液
1. 铁蛋白的提取
⑴ 配制2%硫酸铵液，并以1 mol/L的NaOH或 hCl调ph值，正好为5.85。取1 g铁蛋白溶于100 ml的2%硫酸铵液中。
⑵ 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4 ℃过夜。
⑶ 1 500 g离心(4 ℃)2 h，去上清。仍加2%硫酸铵至100 ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。
⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。
⑸ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。
⑹ 以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。
⑺ 重复步骤⑹一次。
⑻ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24 h后,以0. 05 mol/L p h 7. 5PBS透析24 h。
⑼ 100 000 r/ min离心2 h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4 ℃过夜。
⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45 μ)过滤，使铁蛋白含量为65 mg/ ml～75 mg/ ml，分装，4 ℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。
2. 铁蛋白－抗体交联法
⑴ 以0. 3 mol/L ph 9. 5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20 mg/ ml～25 mg/ ml。
⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45 min，离心去沉淀。
⑶ 以0. 3 mol/L ph 9. 5硼酸盐缓冲液将提纯l g配成5 mg/ ml，以1︰4的比例(V/V)加入I g与铁蛋白－XC液，4 ℃搅拌48 h。
⑷ 以0. 1 mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0. 05 mol/L ph 7. 5 PBS透析，使ph值恢复到生理水平。
⑸ 超速离心 以1. 00×105 g离心5 h，去上清，沉淀以0. 05 mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的I g。
⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。
3. 铁蛋白－抗体结合物处理标本
（1）将标本以5%福尔马林p h 7. 2(4 ℃)PBS液固定40 min～60 min。
（2）用冷的PBS液洗涤，离心。
（3）如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20 min，不时振荡,
（4）以冷PBS液洗涤三次，离心。
（5）沉淀以2. 5%戊二醛固定20 min，以PBS洗涤。
（6）再以锇酸固定，脱水包埋。
也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下：
⑴ 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4 ℃)。
⑵ PBS液洗涤离心。
⑶ 以0. 5 ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（p h7. 5）中固定3 h。
⑷ 取出，切成小块，以PBS液洗涤。
⑸ 置干燥器中以硅胶干燥。
⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。
⑺ 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。
⑻ 5 min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。
⑼ 凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。
⑽ 水洗、晾干、电镜观察。
