铁蛋白免疫电镜

原理

 

 

免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。

 

 

 

材料与试剂

 

1 ．马脾铁蛋白

2 ．硫酸铵

3 ．硫酸镉

4 ．双异氰酸镉二甲苯 (Metaxylene dlisocyante XC) 以 0.30Mol/L pH 9.5 硼酸盐缓冲液将 XC 配制成 1% 溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置 4 ℃ 数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀 XC 的多聚体形成，应重配。

5 ． 0.30Mol/L pH 9.5 硼盐酸缓冲液

6 ． 0.1Mol/L 硫酸铵液

7 ． 0.05Mol/L pH 7.4 PBS 液

 

 

 

操作方法

 

1 ．铁蛋白的提取

⑴ 配制 2% 硫酸铵液，并以 1Mol/L 的 NaOH 或 HCl 调 pH 值，正好为 5.85 。取 1g 铁蛋白溶于 100ml 的 2% 硫酸铵液中。

⑵ 加入 20% 硫酸镉，使最终浓度为 5% ，混匀， 4 ℃ 过夜。

⑶ 1 500g 离心 ( 4 ℃ )2h ，去上清。仍加 2% 硫酸铵至 100ml ，混匀，离心，去除不纯沉渣。

⑷ 于上清液中重新加入 20% 硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。

⑸ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。

⑹ 以少量的蒸馏水溶解，再加 50% 饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。

⑺ 重复步骤 ⑹ 一次。

⑻ 以少量蒸馏水溶解 , 常水透析 24h 后 , 以 0.05Mol/L pH 7.5PBS 透析 24h 。

⑼ 100 000r/min 离心 2h ，去除上部无色上清液 ( 约 3/4 总量 ) ，置 4 ℃ 过夜。

⑽ 用微孔滤膜 ( 孔径 0.45 μ ) 过滤，使铁蛋白含量为 65mg/ml ～ 75mg/ml ，分装， 4 ℃ 保存不要冻干保存 , 以免铁蛋白结构遭破坏。

2 ．铁蛋白－抗体交联法

⑴ 以 0.3Mol/L pH 9.5 硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成 20mg/ml ～ 25mg/ml 。

⑵ 以 1 ︰ 1000(W/W) 的比例加入 XC 液室温搅拌 45min ，离心去沉淀。

⑶ 以 0.3Mol/L pH 9.5 硼酸盐缓冲液将提纯 lgG 配成 5mg/ml ，以 1 ︰ 4 的比例 (V/V) 加入 IgG 与铁蛋白－ XC 液， 4 ℃ 搅拌 48h 。

⑷ 以 0.1Mol/L 碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以 0.05Mol/l pH 7.5 PBS 透析，使 pH 值恢复到生理水平。

⑸ 超速离心 以 1.00 × 10⁵ g 离心 5h ，去上清，沉淀以 0.05Mol/L PBS 悬浮，再次离心，以除去未结合的 IgG 。

⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。

3 ．铁蛋白－抗体结合物处理标本

（ 1 ）将标本以 5% 福尔马林 pH 7.2( 4 ℃ )PBS 液固定 40min ～ 60min 。

（ 2 ）用冷的 PBS 液洗涤，离心。

（ 3 ）如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温 20min ，不时振荡 ,

（ 4 ）以冷 PBS 液洗涤三次，离心。

（ 5 ）沉淀以 2.5% 戊二醛固定 20min ，以 PBS 洗涤。

（ 6 ）再以锇酸固定，脱水包埋。

也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下：

⑴ 将培养细胞以 1% 福尔马林 PBS 液固定 ( 4 ℃ ) 。

⑵ PBS 液洗涤离心。

⑶ 以 0.5ml,30% 牛血清蛋白 PBS 液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至 2% 戊二醛 PBS 液（ pH7.5 ）中固定 3h 。

⑷ 取出，切成小块，以 PBS 液洗涤。

⑸ 置干燥器中以硅胶干燥。

⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经 4% 牛血清白蛋白 PBS 液处理的披有胶膜的载网上 ( 牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上 ) 。

⑺ 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。

⑻ 5min 后，浮网于 PBS 液面 , 标本面向下，以除去多余的结合物。

⑼ 凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。

⑽ 水洗、晾干、电镜观察。

 

 

 

结果判定

 

在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性 ( ＋ ) ，否则判为阴性 ( － ) 。