HLA基因分型方法：PCR－SSO（ASO）探针法

PCR － SSO （ ASO ）探针法

 

1 ）常规提取 DNA

 

参见 RFLP 法

 

 

2 ） PCR 扩增

 

参见 PCR-RFLP 法

 

 

3 ）斑点杂交

 

1． 将 5 ～ 20 μ l 扩增产物，加变性液 100 ～ 200 μ l 室温处理 5 ～ 15min 。

2． 在尼龙滤膜（预先用 2 × SSC 浸湿 2min ）上真空点样，每孔以 10 × SSPE 200 μ l 冲洗，抽干， 80 ℃干燥 2h 。

3． 标记探针，取标记缓冲液 2.5 μ l ，寡核苷酸片段（ dCTP, dGTP, dTTP ） 50 ～ 100ng ， [ γ -³² P]ATP 2.5 μ l ， T4 多核苷酸酶 10U ，双蒸水加至 25 μ l ，混匀， 37 ℃保温 45min ，用 0.5mol/L EDTA 1 μ l 终止反应，标记的探针可直接使用或采用柱层析分离标记好的探针。

4． 点样膜于杂交前漂洗，放入杂交袋中，加入适量预杂交液 2ml/10cm² 在杂交温度下预杂交 10 ～ 60min ，将适量标记探针加入预杂交液中，杂交 1h ～过夜。

5． 洗膜， 2 × SSPE 和 0.1 ％ SDS 于杂交温度洗 2 次，最后根据探针的 Tm 值调整洗膜 2 次。

6． － 70 ℃放射自显影，用保鲜膜包好杂交膜，放入暗盒，加增感屏，再放置 X 线片，置低温冰箱，感光时间须摸索。