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        HLA基因分型方法:PCR-RFLP法

        互联网

        2252

         

        PCR RFLP

         

        1 )提取细胞总 DNA

         

        方法同前。

         

         

        2 PCR 扩增引物的设计

         

        1. 引物长度一般为 15 30bp G C 含量应在 45 %~ 55 %之间。

        2. 应避免连续出现 4 个以上的单一碱基。

        3. 不能含有自身互补序列。

        4. 两个引物之间不应有多于 4 个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体。

        5. 与非特异扩增序列的同源性应小于 70 %,或少于连续 8 个互补碱基。

        6. 扩增 HLA-D 区基因多态性区段的引物应在该区第二外显子或高变区的边缘。

         

         

        3 PCR 扩增

         

        1. 100 μ l 反应体系中分别加入:缓冲液 10 μ l ,引物各 25pmol DNA 1 2 μ g 10 μ l dNTPs ,混合均匀后在 95 97 ℃变性 5 10min

        2. Taq DNA 聚合酶 2U ,液体石蜡 50 μ l 覆盖放置水分蒸发,将样品置 PCR 扩增仪中完成扩增反应,变性,退火,延伸温度时间及 Mg2 的浓度随扩增引物及区段的不同而改变。

         

         

        4 )限制性内切酶消化

         

        5 μ l PCR 产物分别用 2 个单位限制性内切酶(如 HinfI )在总体积为 12 μ l 的反应体积中酶解, 37 ℃保温 2 3h

         

         

        5 )凝胶电泳

         

        12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳, 200V 3h ,用 0.5 μ g/ml 溴化乙锭( EB )染色 30min ,照相分析图形。

         

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