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        培养细胞中RNA检测-Northern Blot

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        1638

         

        培养细胞中 RNA 检测- Northern Blot

         

        1. 制胶:( 1 %)

        琼脂糖                 2.5g

         

        10 × Mops 缓冲液    25.0ml

         

        H2 O               192.0ml

        2. 在微波炉中加热煮沸使胶完全溶于水并灭菌。

        3. 取出胶冷却到 60 ℃,于通风柜中加 45ml 甲醛,混匀。

        4. 20 μ l 溴化乙锭,混匀。

        5. 令胶液再冷却 10 分钟。

        6. 将其倒入四面封好的电泳槽中,加样品梳,约 20 分钟形成电泳凝胶。

        7. 加入 1 × Mops 缓冲液于电泳槽,盖满胶表面,但不 >1cm

        8. 10 15 μ g RNA 样品,真空离心干燥,再溶于 20 μ l 载样缓冲液,加热 95 2 分钟,使 RNA 变性。

        9. 每孔中 20 μ l RNA 点样,同时加一标准物。

        10.  一般 35V 电泳,从下午 4pm 9 30am

        11.  取出胶在紫外灯下观察,将刻度尺放在胶旁照像。成功的电泳在胶上 28S (约 5kb 18s (约 2kb )处可见明显的溴化乙锭带。

        12.  500ml 10 × SSC 浸泡洗涤胶 2 次,每次 20 分钟,去除甲醛。

        13.  其它吸印步骤完全与 Southern Blot 相同,只是吸印缓冲液为 10 × SSC

        14.  室温下至少吸印 12 小时。

        15.  吸印完成后,取出胶与滤膜,表明加样起始部位、膜的方向及标号、用 Whatman 滤纸包好, 80 ℃真空干燥 2 小时;如为尼龙膜在紫外灯下照射 5 分钟。

        16.  分子杂交:杂交原理与 Southern Blot 相同,但所用杂交液及杂交、洗涤温度与之不同。预杂交液制备:

        50 甲酰胺

         

        1 SDS

         

        1M NaCl

         

        10 硫酸葡聚糖

        17.  将滤膜放入塑料袋,加入 10ml 预杂交液,去除气泡后封袋,在 42 ℃水浴中振荡至少 6 小时。

        18.  制备变性鱼精 DNA 100 μ g/ml ,变性同位素标记的探针(加入袋中的终浓度≤ 10ng/ml 1 4 × 105 dpm/ml )。

        19.  将此液 0.5 1ml 以针头注入含预杂交液的塑料袋中,排除气泡,从针眼处重新封死塑料袋,再用玻棒在袋上赶几次,使探针与预杂交液充分混匀, 42 ℃振荡水浴 6 42 小时。

        20.  膜的洗涤:

        a.       2 × SSC 100ml 室温中振荡 5 分钟,共 2 次。

        b.      1 SDS 2 × SSC 200ml 60 ℃振荡 30 分钟,共 2 次。

        c.       0.1 × SSC 100ml 室温振荡 30 分钟,共 2 次。

         

        21. 膜在室温中自然干燥后,用塑料纸包好即可进行放射自显影过程(同 DNA 检测)。

         

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