Northern Blot方法检测培养细胞中RNA

相关专题

Northern Blotting技术专题

1.制胶：(1%)

琼脂 糖 2.5g

10×Mops缓冲液 25.0ml

H2O 192.0ml

2.在微波炉中加热煮沸使胶完全溶于水并灭菌。

3.取出胶冷却到60℃，于通风柜中加45ml甲醛，混匀。

4.加20μl溴化乙锭，混匀。

5.令胶液再冷却10分钟。

6.将其倒入四面封好的电泳槽 中，加样品梳，约20分钟形成电泳凝胶。

7.加入1×Mops缓冲液于电泳槽，盖满胶表面，但不>1cm。

8.取10～15μg RNA样品，真空离心干燥，再溶于20μl载样缓冲液，加热95℃ 2分钟，使RNA变性。

9.每孔中20μl RNA点样，同时加一标准物。

10. 一般35V电泳，从下午4pm～9：30am。

11. 取出胶在紫外灯下观察，将刻度尺放在胶旁照像。成功的电泳在胶上28S(约5kb)18s(约2kb)处可见明显的溴化乙锭带。

12. 用500ml 10

SSC浸泡洗涤胶2次，每次20分钟，去除甲醛。

13. 其它吸印步骤完全与Southern Blot相同，只是吸印缓冲液为10×SSC。

14. 室温下至少吸印12小时。

15. 吸印完成后，取出胶与滤膜，表明加样起始部位、膜的方向及标号、用Whatman滤纸包好，80℃真空干燥2小时;如为尼龙膜在紫外灯下照射5分钟。

16. 分子 杂交：杂交原理与Southern Blot相同，但所用杂交液及杂交、洗涤温度与之不同。预杂交液制备：

50% 甲酰胺

1% SDS

1M NaCl

10% 硫酸葡聚糖

17. 将滤膜放入塑料袋，加入10ml预杂交液，去除气泡后封袋，在42℃水浴中振荡至少6小时。

18. 制备变性鱼精DNA≥100μg/ml，变性同位素标记的探针(加入袋中的终浓度≤10ng/ml或1～4×105dpm/ml)。

19. 将此液0.5～1ml以针头注入含预杂交液的塑料袋中，排除气泡，从针眼处重新封死塑料袋，再用玻棒在袋上赶几次，使探针与预杂交液充分混匀，42℃振荡水浴6～42小时。

20. 膜的洗涤：

a. 2×SSC 100ml室温中振荡5分钟，共2次。

b. 1%SDS

2×SSC 200ml 60℃振荡30分钟，共2次。

c. 0.1×SSC 100ml室温振荡30分钟，共2次。

21. 膜在室温中自然干燥后，用塑料纸包好即可进行放射自显影过程(同DNA检测)。