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        northern blot 内参探针

        相关实验:核酸免疫实验

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        七里5C0Q

        请教一下大家,做northern blot的内参基因探针设计有什么原则吗?怎么设计的?直接在数据库中搜序列然后设计吗?第一次设计这个,拜托大佬帮忙解答一下🙏🙏

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        5 个回答

        user-title

        Dr_劉医生

        有帮助

        对呀,和跑DNA的southern blot基本一样,在数据库检索序列片段,看外显子位置;但因为northern做的RNA是单链,需要和互补的RNA探针引物结合;所以在做northern的时候最好选择cDNA探针,若选用DNA探针,则尽量设计在外显子部分。此外, 探针长度最好在100-1000bp之间,大于1000bp则背景很高,很难区分异源序列

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        灵枢天问

        有帮助

        你可以直接在数据库搜序列然后premier5设计就好了原则上没有区别

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        土井挞克树

        有帮助

        你可以直接从数据库里面搜索,也可以用你的师兄弟们的内参探针,也可以参考已经发表的论文设计,但是你后续论文撰写阶段要说明探针序列来源。

        user-title

        墨幽染染

        有帮助

        探针设计的基本原则:

        1.保守:探针要绝对的保守,有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对,就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段,也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间,对探针与目的片段的杂交影响不大,不相同的碱基最好不要在两端,因为两端不利于探针的杂交。且最好为AT,而不能为GA,因为AT为双键,而GA为三键。

        2.探针长度

        Tagman探针的长度最好在25-32bp之间,且Tm值在68-72℃之间,最好为70℃,确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃,这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段,保证其的Tm值较高。现在有Tagman MGB探针,在TAMER之后再标记一个MGB,可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短,也可达到Tagman探针的Tm值要求(68-70℃)

        3.探针的名称

        应标记探针在基因组的位置及长度。

        4.探针Tm值计算

        oligoprimer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。

        5.探针的评价

        DNAstar软件中的Primerselect?软件,点击“log”菜单中的“create primer catalog”,在“name”中输入探针的名称、位置,按Tab键进入“sequence”,粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后,在“report”菜单下“orimer selfdimeri”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer,并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值理论上是dG值越大越好)。在“report'”菜单下“primer hairpinsi”,分析探针的发夹结构。

        6.探针的5’端不能为G,因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时,G可以淬FAM基团所发出的荧光信号,从而导致假阴性的出现

        7.Tagman探针与引物之间的位置Tagman探针应靠近上游引物,即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5端离上游引物的3’有一个碱基,但也可以重叠,要保证Tagman探针的5'端离上游引物的5'端至少有4bp

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        探针设计原则1.探针需在反义链上:才能跟mRNA互补,启动子应在3'末端编码区。双链RNA探针需含有意义链和反义链。合成单链探针时要考虑合成的是反义RNA,启动子应在3末端。启动子的位置;在反义链3端使用启动子1产生的正义RNA探针,在反义链5端使用启动子2产生的反义链RNA探针。启动子的位置;在反义链3端使用启动子1产生的正义RNA探针,在反义链5端使用启动子2产生的反义链RNA探针。2.探针长度:在100-1000之间,大于1000则产生高背景,很难区分异源序列。如果用随机引物标记,探针长度为模板长度的一半。如果模板长度少于100,杂交温度和洗脱则按照寡核酸白心进行。3.探针序列:探针应含有最少的非同源序列(探针尽可能含有跟模板误配的碱基。4.标记:放射性或非放射性标记。5.寡核苷酸探针:至少15bp,但标记效率差,灵敏度低。每一个杂交分子只有一个标记分子

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