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        不连续SDS

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        一、原理及目的(略)
        二、试剂
        1、30%丙烯酰胺贮存液:29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中,验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中,4℃保存。
        2、1.5mol/L Tris(pH8.8)溶液
        3、10% SDS溶液
        4、10%过硫酸铵:新鲜配制
        5、TEMED溶液:4℃保存
        6、1.0 mol/L Tris(pH6.8)溶液
        7、2×样品溶解液:2%SDS,5%巯基乙醇,10%甘油,0.02%溴酚蓝,0.01mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液。
        8、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液:每1000ml该溶液中,含15.1g Tris,94g甘氨酸和50ml 10%(W/V)SDS贮存液。
        9、固定液:冰乙酸:甲醇:水=1:2:7
        10、考马斯亮蓝R染色液:每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物(9:9:2)中,溶解0.25g考马斯亮蓝R,过滤除去未溶物。
        11、脱色液:甲醇:水:冰乙酸=9:9:2
        注:1、2、5、6、7由教师提供,其余由学生自己配制,其中8可在凝胶凝固的过程中配制,9、10、11在电泳时配制。
        三、操作步骤:
        1、准备步骤
        1)将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净,然后使其自然风干或烘干。
        2)试样格(梳子)临用前用无水乙醇擦拭,让其挥发至干。
        3)灭菌枪头、eppendorf 管。
        2、制备凝胶
        1)安装玻璃板、板条,并将玻璃板固定在电泳槽中,以5%琼脂 封底。
        2)配制10%的分离胶(20ml):依次将8ml蒸馏水,6.7ml 30%丙烯酰胺贮存液,5ml 1.5mol/L Tris(pH8.8)溶液,0.2ml 10% SDS溶液,0.2ml 10%过硫酸铵,0.008mlTEMED混合,立即灌胶。
        3)迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶,直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。
        4)在分离胶聚合的过程(约40分钟)中,配制5%的积层胶(8ml):依次混合5.5ml蒸馏水,1.3ml 30%丙烯酰胺贮存液,1.0ml 1.0 mol/L Tris(pH6.8)溶液,0.08ml 10% SDS溶液,0.08ml 10%过硫酸铵,0.008TEMED。TEMED应在灌胶前才加入。
        5)分离胶聚合完全后,倒去正丁醇,用蒸馏水冲洗胶面数次,用滤纸吸干胶面上的残余水。
        6)灌注积层胶,立即插入干净的梳子,避免产生气泡。
        7)积层胶聚合完全后,小心拔出梳子,用移液器 吸取电极缓冲液清洗加样孔数次,以除去未聚合的丙烯酰胺。
        8)在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。
        3、样品的制备
        在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液,使蛋白的终浓度为3-4mg/ml,混合液在沸水浴中加热3分钟,冷却后即可上样。
        4、上样
        用微量进样器上样,每加入一种样品,应在下槽中洗涤加样器数次,最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。
        5、电泳
        装好冷凝水系统,打开电源,初始电压为100-120V,当染料进入分离胶(这段时间约为20min)后,将电压提高到200-220V,继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。
        6、后处理
        1)固定:从电泳装置上卸下玻璃板,用镊子小心撬开玻璃板,除去积层胶部分,将分离胶移入固定液(固定液的量至少为胶体积的5倍)中固定,直至染料由蓝绿色变为黄色。
        2)染色:除去固定液,加入染色液(用量同上),室温染色8小时或60℃染色2小时。
        3)脱色:回收染色液,将凝胶浸泡于脱色液中,直至背景脱至无色,其间更换脱色液3-4次。
        四、结果
        绘制蛋白图谱,并对其进行必要说明。
        五、注意事项
        N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质,可经皮肤直接吸收,使用时应避免其直接接触皮肤,必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。
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