不连续梯度法

通过不连续或预先形成的氯化铯（CsCl）梯度离心，可在离心管中获得含有不同浓度 CsCl 的溶液分层，样品位于中层（三级梯度法）或底层（两级梯度法）。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

CsCl ( 固体）（用于三级不连续梯度的 CsCl 液层），溴化乙锭（10 mg/ml )，TE ( pH 8.0)。



2. 核酸和寡核苷酸

粗制质粒样品

每个梯度的 DNA 用量宜来自不超过 50 ml 过夜培养物的粗制质粒。来自 100 ml 培养物的粗制质粒样品则应重溶于约 0.9 ml TE（pH 8.0）中，从而在两个不连续梯度之间足以形成一个中间层。

3. 专用设备

皮下注射针头（21 号），折光仪（可选），带有 18 号骨髓针头（10 cm）的注射器（3 ml、5 ml 和 5~10 ml），带有 18 号骨髓针头（10 cm）的结核菌素注射器（1 ml）。

4. 离心机和转子

超速离心转子和离心管

带有 5 ml 或 10 ml polyallomer 超速离心管的 Beckman 型 70.1 Ti 或 Sovall 型 65.13 转子（Beckman Quich-Seal 或相当产品）。

二、方法

1. 用一个带有 18 号骨髓针头（10 cm ) 的 3 ml 皮下注射器，转移 1.5 ml 顶层 CsCl 溶液 ( 35%) 至一个 5 ml polyallomer 超速离心管（Beckman Quich-Seal 或相当产品）中。

2. 用一个带有 18 号骨髄针头（10 cm ) 的 1 ml 结核菌素注射器，将 0.5 ml 含有质粒 DNA 的中层 CsCI 溶液（44% ) 铺于顶层液下方的离心管底部。

3. 用一个带有 18 号骨髓针头（10 cm ) 的 5 ml 皮下注射器，将底层 CsCl 溶液（59% ) 铺于中层 CsCl 溶液下方、充满离心管。

4. 将该密封的离心管以 330000 g ( 60000 r/min, Beckman 型 70.1 Ti 转子）离心 5 h。离心时确保转子中离心管重量的平衡。按照厂家说明密封离心管。

使用更高速的离心机和转子能够进一步减少离心时间。例如，使用 Beckman Xl-90 的 Vti90 转子，只需离心 20 min。

5. 收集闭环 DNA 区带：

(1) 用 21 号皮下注射针头在离心管顶端扎一个小孔以使液体被吸出时空气能进入。

(2) 用乙醇小心擦拭离心管外壁以除去任何油脂，然后用一块 Scotch 胶带或 Time 胶带贴于管外壁。

胶带起密封作用以减少针头穿刺后的泄漏。

(3) 将一个 5~10 ml 的一次性注射器装上一个无菌的 18 号皮下注射针头，将针头斜面向上地穿过胶带插入管中，以使针头的斜面开口正好位于较低的 DNA 区带 ( 闭环质粒 DNA ) 的下方。

(4) 缓慢吸出质粒 DNA，小心不要搅动上方黏稠的染色体 DNA 区带。

欲避免染色体 DNA 的污染，不要试图从梯带中移去毎一点可见的痕量闭环质粒 DNA。

有些研究者喜欢在移去较低的闭环质粒 DNA 区带之前先去除较上方的 DNA 区带。此法不太可取，这是因为位于较上层的黏稠的高分子质量染色体 DNA 能缠绕住闭环质粒 DNA 并将其带出离心管。



6. 从 DNA 中去除溴化乙锭。