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        网友总结:免疫共沉淀实验成功3大关键

        相关方法:免疫共沉淀技术

        互联网

        1982
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        一、个人总结的成败因素:

        1. 有效裂解细胞。

        2. 恰当选择处理样本的方式:超声或酶处理。

        3. 选用适当适量抗体。

        4. 恰当设置对照。

        5. 不要过分交联DNA-蛋白质。

        6. 交联所用的甲醛终浓度约为1%,交联时问需要预实验来确定。

        7 . 注意PCR策略具体来说:恰当设置ChIP 实验对照,设置适当的阳性和阴性对照是进行ChIP结果分析的重要步骤和Trouble shooting的依据,因为非特异性的免疫沉淀难以避免。

        一般的设置方法

        1 未经免疫 沉淀的超声处理后样本( INPUT)。

        2 加特异抗体来源动物的正常血清或无关抗体(MOCK)。

        3 阳性对照引物的应用。

        4 选择不与目的蛋白质结合的基因组 区域作对照。

        如 阳性对照抗体 (Anti-acetyl-Histone H3)

        ~undefined 阴性对照抗体 (Normal Rabbit IgG)

        ~undefined PCR引物 (control primer specific for human GAPDH)

        二 、抗体选择,尽可能选择试剂公司验证过的CHIP级抗体,如upstate公司。

        与目的蛋白比,抗体应过量,预实验确定抗体用量,选用高质量高滴度抗体。

        抗体识别位点不是DNA-Pro结合的位点。

        三、ChIP耗时长,什么时候能够停止并且冷冻样本?

        I. 甲醛固定和冲洗以后离心下形成的细胞球状聚合体。

        II. 细胞溶液(lysate)。

        III. 声波裂解染色质后。

        IV. 在逆转交联后。

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