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        DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离

        互联网

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        一.实验目的及背景
        在生物技术实验中,PCR反应获得的目的片段,酶切后所得特定的DNA序列, 分子杂交中所制备的探针等,经过琼脂糖凝胶电泳后,目的片段与其它DNA分开, 这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来,通过处理后得到纯化的目的DNA, 以用于以后分子杂交,重组 子构建,序列分析等.

        从凝胶中分离回收DNA的方法
        现在常用的技术有:
        电洗脱法
        低熔点琼脂 糖凝胶法
        DNA滤膜插片法等
        其中电洗脱法,经济节省,操作方便, 对DNA的回收效果好。

        低熔点琼脂 糖凝胶法
        65oC琼脂 糖凝胶熔点
        低熔点琼脂 糖凝胶 37oC 液体

        DNA滤膜插片法
        High efficient
        DNA high quality for microinjection
        <5kb fragment
        100ng DNA fragment
        10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes
        0.5 mol/L NaOH 5 minutes
        低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
        高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)

        电洗脱法基本原理
        将电泳分离后含目的DNA片段的琼脂糖切割下来, 装于透析袋中,继续在高电压下电泳,这时目的DNA会从凝胶中电泳出进入透析袋中, 由于DNA分子量大,不能透过透析袋,从而保留于透析袋中。
        取出透析袋中含DNA的溶液, 进一步用酚、氯仿抽提纯化。


        三、实验方法
        (一)透析袋的处理:
        1.切取适当长度适析袋。
        2.在2%NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸10分钟。
        3.弃去煮沸液,加无菌水内外反复洗净透析袋。

        (二)电洗脱
        1.在长波紫外灯下(300-360nm )将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中。
        2.向透析袋内加入2ml电泳缓冲液,使之浸没凝胶,并排空汽泡。
        3.将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行), 加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)。
        4.接通电源,150伏电洗,在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶。
        5.改变电场方向继续通电1分钟。
        6.从透析袋中吸出缓冲液于1-5ml Eppendorf管中。
        7.加入1.5倍体积正丁醇,混匀抽提去EB。
        8.在台式离心机上最高速2分钟。
        9.吸去上层,正丁醇溶液。
        10.重复7,8,9二次。
        11.自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次。
        12.上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc 2倍体积预冷无水乙醇,于20℃过夜。
        13.12000g,4℃下离心10分钟,得DNA沉淀。
        14.弃上清,加入70%乙醇洗涤2次后弃干乙醇。
        15.加入50μl TE溶解DNA。
        16.取10μl DNA溶液加入2μl Loading buffer于0.8%琼脂糖上, 40伏电泳,3小时。
        17.在紫外透射仪上观察结果。
        18.测定DNA溶液OD260,OD280值。

        结果与分析
        1.计算DNA回收效率,判断DNA纯度。
        2.记录电泳结果
        问题与讨论:
        1.电洗脱过程后,为什么要反向电泳1分钟?
        2.电洗脱后的DNA如何去除EB?
         

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