DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离

互联网2013-08-27

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一．实验目的及背景
在生物技术实验中，PCR反应获得的目的片段，酶切后所得特定的DNA序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它DNA分开，这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的DNA，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等.

从凝胶中分离回收DNA的方法
现在常用的技术有：
电洗脱法
低熔点琼脂糖凝胶法
DNA滤膜插片法等
其中电洗脱法，经济节省，操作方便，对DNA的回收效果好。

低熔点琼脂糖凝胶法
65oC琼脂糖凝胶熔点
低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体

DNA滤膜插片法
High efficient
DNA high quality for microinjection
<5kb fragment
100ng DNA fragment
10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes
0.5 mol/L NaOH 5 minutes
低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)

电洗脱法基本原理
将电泳分离后含目的DNA片段的琼脂糖切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的DNA会从凝胶中电泳出进入透析袋中，由于DNA分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。
取出透析袋中含DNA的溶液，进一步用酚、氯仿抽提纯化。

三、实验方法
（一）透析袋的处理：
1．切取适当长度适析袋。
2．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸10分钟。
3．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。

（二）电洗脱
1．在长波紫外灯下（300－360nm ）将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中。
2．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。
3．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行），加入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。
4．接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶。
5．改变电场方向继续通电1分钟。
6．从透析袋中吸出缓冲液于1－5ml Eppendorf管中。
7．加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB。
8．在台式离心机上最高速2分钟。
9．吸去上层，正丁醇溶液。
10．重复7，8，9二次。
11．自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿（２个）抽提２次。
12．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于20℃过夜。
13．12000g，4℃下离心10分钟，得DNA沉淀。
14．弃上清，加入70％乙醇洗涤２次后弃干乙醇。
15．加入50μl TE溶解DNA。
16．取10μl DNA溶液加入2μl Loading buffer于0.8％琼脂糖上， 40伏电泳，3小时。
17．在紫外透射仪上观察结果。
18．测定DNA溶液OD260,OD280值。