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        目的DNA片段的分离、回收

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        【实验原理】
        琼脂 糖凝胶电泳与醋酸纤维素薄膜电泳原理基本相同,但兼有分子筛效应,从而使不同分子量大小的DNA片段分离。琼脂糖是从琼脂中提取出来的含有较多的酸根和羟基多糖。回收DNA的方法很多,主要包括DEAE纤维素纸插片电泳法、透析袋电泳洗脱法、槽沟电泳洗脱法、v形槽电泳洗脱法以及低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法。本实验采用琼脂糖凝胶DNA片段纯化试剂盒,此试剂盒采用独特的凝胶融解系统,结合DNA制备膜技术,具有高效、快速、方便之特点,全套操作只需要30分钟便可完成。使用此试剂盒每次可纯化得到多至10μg 的DNA片段(100bp -30kb ),回收率高达50-80%。
        【器材】
        1.紫外分光仪
        2.离心机
        【试剂】
        1.琼脂 糖凝胶
        2.DNA Purification Kit(Takara )
        【操作步骤】
        1.使用TAE缓冲液制作琼脂 糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
        2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂 糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
        3.切碎胶块。
        4.称量胶块重量,计算胶块体积(1mg =1μl)。
        5.向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer, DR-I Buffer 的加量如下表:

         

        凝胶浓度

        DR-I Buffer 使用量

        1.0%

        3个凝胶体积量

        1.0-1.5%

        4个凝胶体积量

        1.5-2.0%

        5个凝胶体积量

        6.均匀混合后75℃加热融化胶块(低溶点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。振荡混合,使胶块充分融化(约6-10min)。
        7.向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 量的1/2体积量的DR-II Buffer,均匀混合。当分离小于400bp的 DNA片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
        8.将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube上。
        9.将上述操作7的溶液转移至Spin Column中,3600rpm 离心1min。
        10.将500μl 的Rinse A 加入Spin Column中,3600rpm 离心30Sec,弃滤液。
        11.将700μl的Rinse B加入Spin Colum中,Spin Colum中,离心30Sec ,弃滤液。
        12.重复操作步骤11,然后12 000 rpm再离心1min。
        13.将Spin Column按置于1.5ml 的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入25μl的水或洗脱液,室温静置1min。
        14.12 000 rpm离心1min 洗脱DNA。
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