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        植物基因组DNA的提取

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        一、实验目的
        掌握植物 总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
        二、实验原理
        通常采用机械研磨的方法破碎植物 的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。
        十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜 和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。
        三、实验材料
        水稻幼叶
        四、主要试剂配方
        2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 (400ul) 氯仿-异戊醇(24:1):先加96ml氯仿,再加4ml异戊醇,摇匀即可。
        五、实验步骤
        1. DNA的提取
        (1) 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
        (2)取少量叶片(约1g)置于研钵中,用液氮磨至粉状;
        (3) 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液,轻轻搅动;
        (4) 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中,磨碎液的高度约占管的三分之二;
        (5)置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10 min轻轻摇动,40 min后取出;
        (6)冷却2 min后,加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管,剧烈振荡2~3 min,使两者混合均匀;
        (7)放入离心机 中10 000 rpm离心10 min,与此同时,将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中;
        (8) 10 000 rpm离心1 min后,移液器轻轻地吸取上清夜,转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动30 sec,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物;
        (9)10000 rpm离心1 min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出,将离心管倒立于铺开的纸巾上; (10)60 sec后,直立离心管,加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中;
        (11)放置30 min,使DNA块状物的不纯物溶解;
        (12)10000 rpm离心1 min后,倒掉液体,再加入800 µl 75%的乙醇,将DNA再洗 30 min;
        (13)10000 rpm离心30 sec后,立即倒掉液体,将离心管倒立于铺开的纸巾上;数分钟后,直立离心管,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干);
        (14)加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液,使DNA溶解,置于37℃恒温箱约15 h,使RNA消解;
        (15)置于-20℃保存、备用。
        2. DNA质量检测
        琼脂糖电泳检测,原理和方法见实验二。
        六、 注意事项
        (1)叶片磨得越细越好。
        (2)移液器的使用。
        (3)由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。
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