血液基因组非柱式提取试剂盒（0.1-20 mL），阿拉丁

产品简介

本试剂盒提供了一种快速、灵活的方法，适用于提取新鲜或冷冻全血（用柠檬酸盐、EDTA或肝素等抗凝剂处理过的样品）总DNA，包括基因组DNA和线粒体DNA。本品可以灵活处理0.1-20    ml的全血，采用非离心柱的方法，无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂，有效去除蛋白、色素、脂类及其它抑制性杂质污染。整个过程在一个管中操作，  减少了污染及样本混淆的风险。提取的DNA产量高、质量好，可直接用于PCR、荧光定量PCR、酶切和Southern Blot以及文库构建等实验。

产品特点

· 纯度高：提取的基因组DNA可直接用于下游PCR、荧光定量PCR、酶切等各种实验。

·提取量大：可从0.1-20 ml的全血中提取DNA，无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂。

·兼容性强：适用于处理各种血液和细胞样本。

自备试剂：异丙醇、70%乙醇。

实验前准备及重要注意事项

1.向Proteinase K中加入指定用量的Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase K勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。

2.所有离心操作均在室温下完成。
3.血液样品反复冻融，会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。所得基因组DNA也应尽可能避免反复冻融，以免降解。如果提取冷冻血液的基因组DNA，建议37℃水浴，迅速解冻后再进行后续操作。
4.血液样品的储存：
1）短期保存：已加入抗凝剂的血液样品可在2-8℃储存最多10天，对于某些实验例如Southern杂交等，需要得到完整全长的基因组DNA，请将血液样品在2-8℃储存不 超过3天，此时基因组DNA的降解程度较轻。
长期保存：已加入抗凝剂的血液请置于-70℃保存（如果提取的是高分子量的DNA，推荐使用EDTA作为抗凝剂）。

操作步骤

一、从100–900 µl全血中提取基因组 （以300 µl 血液处理量为例）
1. 取300 μl全血于2 ml离心管（自备）中，加入300 μl（样本等体积）Buffer FG1，上下颠倒混匀5次，10,000×g离心30秒，弃上清。
2. 再向离心管中加入450 μl（1.5倍样本体积）Buffer FG1，涡旋震荡，使沉淀完全分散。10,000 g离心30秒，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。
3. 按照附表配制Buffer FG2与Proteinase K的混合液（比例100:1）。
注意：此混合液最好现用现配，并在配好后1小时之内用完。
4. 加入150 μl Buffer FG2与Proteinase K的混合液， 立即涡旋混匀至溶液无团块。注意：1）如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/Proteinase K混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。
2）通常涡旋震荡3-4次，每次5秒，可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以再加入30 μl Buffer FG2/Proteinase K混合液，再次涡旋混匀。
5．65℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次。
注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。
6．加入150 μl异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至出现丝状或簇状基因组DNA。
注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7．10,000×g离心5分钟。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。
8. 弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。
注意：少数时候沉淀可能贴壁不牢，注意不要吸弃沉淀。
9. 加入300 μl 70%乙醇，涡旋震荡5秒，10,000×g离心5分钟，弃上清。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。

10. 把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中。
注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
11. 空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5分钟）。
注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，但避免过度干燥DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。
12. 加入200 μl Buffer GE，低速涡旋5秒，65℃孵育1小时溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。
注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。
二、从1-5 ml全血中提取基因组（以3 ml血液处理量为例）
1. 取3 ml全血于15 ml离心管（自备）中，加入3 ml（样本等体积）Buffer FG1，上下颠倒混匀5次，2,500×g离心5分钟，弃上清。
2. 再向离心管中加入4.5 ml（1.5倍样本体积）Buffer FG1，涡旋震荡，使沉淀完全分散。2,500×g离心5分钟，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管 壁上清的回流。
3. 按照附表配制缓冲液FG2与Proteinase K的混合液（比例100:1）。
注意：此混合液最好现用现配，并在配好后1h之内用完。
4. 加入1.5 ml Buffer FG2/Proteinase K混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。
注意：1）如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/Proteinase K混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。
2）通常涡旋震荡3-4次，每次5秒可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以 再加入300 μl BufferFG2/Proteinase K混合液，再次涡旋混匀。
5．65℃孵育10-30分钟，其间颠倒混匀数次。
注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。
6．加入1.5 ml异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA。
注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至 少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7．2,500×g离心5分钟。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。
8. 弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。
注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
9. 加入1.5 ml 70%乙醇，涡旋震荡5秒，2,500×g离心5分钟，弃上清。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。
10. 把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
11. 空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5分钟）。
注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，但避免过度干燥DNA沉淀，因过度 干燥会使DNA难于溶解。
12. 加入300 μl Buffer GE ，低速涡旋5秒，65℃孵育1小时溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。
注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。
三、从6-20 ml全血中提取基因组（以10 ml血液处理量为例）
1. 取10 ml全血于50 ml离心管（自备）中，加入10 ml Buffer FG1，上下颠倒混匀5次，2,500×g离心5分钟。
2. 再向离心管中加入15ml Buffer FG1，涡旋震荡，使沉淀完全分散。2,500×g离心5
分钟，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
3. 按照附表配制缓冲液FG2与Proteinase K的混合液（比例100:1）。
注意：此混合液最好现用现配，并在配好后1h之内用完。
4. 加入5 ml Buffer FG2/Proteinase K混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。
注意：1）如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/Proteinase K混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。
2）通常涡旋震荡3-4次，每次5秒可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以 再加入1ml BufferFG2/Proteinase K混合液，再次涡旋混匀。
5．65℃孵育30分钟，其间颠倒混匀数次。
注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。
6．加入5 ml异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA。
注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要，应该至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7．2,500×g离心5分钟。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。
8. 弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。
注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
9. 加入5 ml 70%乙醇，涡旋震荡5秒，2,500×g离心5分钟，弃上清。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。
10. 把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
11. 空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5分钟）。
注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，但避免过度干燥DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。
12. 加入1 ml Buffer GE，低速涡旋5秒，65℃孵育1小时溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。
注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。

附表：不同体积血液所需各种缓冲液用量