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        原位PCR和原位RT-PCR操作规程

        互联网

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        原位PCR是Hasse等于1990年建立的技术,就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。

        一、仪器设备

        英国Thermo Hybaid原位PCR仪。

        二、操作流程

        1、原位PCR步骤

        (1)预处理:

        a、切片常规脱蜡;

        b、0.2mol/L HCl处理10min;

        c、5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min;

        d、Nase消化组织37℃ 30min;

        e、梯度酒精脱水,室温干燥。

        (2)原位扩增:

        a、切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;

        b、PCR热循环:94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min,共25~30个循环,72℃延伸10min;

        c、氯仿洗去盖玻片,4%多聚甲醛后固定10min,梯度酒精脱水,干燥。

        (3) 原位杂交:

        a、加地高辛标记探针的杂交液,98℃变性10min,-20℃退火5min,42℃杂交过夜。

        b、杂交后用2×SSC洗涤10min,3次,1×SSC洗涤10min,3次;

        c、缓冲液洗涤10min,3次;

        d、加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物,37℃,2h;

        e、缓冲液洗涤5min,3次;

        f、NBT、BCIP暗处显色,镜下控制,终止显色;

        g、常规脱水:透明、封固。

        2、原位RT-PCR步骤

        (1)预处理:

        a、蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min,蒸馏水洗;

        b、95℃加热3min,灭活残存的蛋白酶。

        (2)原位扩增:

        a、在有RNA酶抑制剂存在的条件下,用随机六聚物进行逆转录反应;

        b、用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液,覆以盖玻片,四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃,2min。再将热循环仪设定为95℃,45s,55℃,1min和75℃,45s,共26次循环;

        c、扩增结束后,在80℃烤15min~30min。

        (3)原位杂交:

        a、杂交前标本95℃加热3min;

        b、加上杂交液,湿盒内50℃过夜;杂交液组成:25%硫酸葡聚糖,2×SSC,50%甲酰胺,0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA, 每0.5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。

        c、扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素,生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。

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