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        DNA的限制性酶切及电泳分析

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        实验目的:
          1.掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。
          2.掌握重组 质粒DNA的酶切鉴定方法。
          3.掌握琼脂 糖凝胶电泳分析酶切结果。
        基本原理
          限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶(水解磷酸二酯键)。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性,可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。
        主要试剂
          重组 质粒DNA 插入片段300bp
          本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ,其识别顺序为:
          5′----G↓AATT C----3′
          3′----C TTAA↑G----5′
        磷酸二脂键断裂 产生5′粘性末端。
        操作步骤
        1. 反应体系的建立:
        ⑴ 在一无菌1.5 ml eppendorf 管中加入:
          无菌双蒸水 7 μl
          10×酶切缓冲液 2 μl
          质粒 DNA(100 ng/μl) 10 μl
          EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl
          总体积为20μl
          ⑵ 轻轻混匀,12000 rpm离心5 sec。
          2. 37 ℃水浴1 h。
          3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min,通过加热使酶失活以终止反应。
          4. 12000 rpm离心5 sec,将管盖及管壁上的水离下。
          5. 取10 μl消化产物,与2 μl 6×上样缓冲液混匀,琼脂糖凝胶电泳检测消化效果,电泳条件:约100 V 30~60 min。
          6 结果观察。
        操作注意事项:
          1. 吸样量一定要准确
          2. 为了不使酶污染而导致浪费,最后才加酶
          3. 要求在冰上操作,并充分混匀,
          4. 开启Eppendorf管时,手不要接触到管盖内面,以防污染。
          5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时,将离心管盖严,以防水进入管内造成实验失败。
        限制性内切酶酶解中常见的问题和原因
          1. DNA完全没有被限制性内切酶切割:①限制性内切酶失活;②DNA不纯,含有SDS、有机溶剂、EDTA等;③非限制性内切酶最佳反应条件;④酶切位点被修饰;⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。
          2. DNA切割不完全:①限制性内切酶活性下降或稀释不正确;②DNA不纯或反应条件不佳;③酶切位点被修饰;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。
          3. DNA片段数目多于理论值:①限制性内切酶星号活力;②存在第二种限制性内切酶污染;③样品DNA中含有其它DNA。
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