限制性酶切标记基因组扫描检测基因突变实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

##一、材料

###1.封闭：偶发的损伤修复（repair of adventitious damage, RAD)

（1）高分子质量基因组 D N A : 330 ug/mL 溶于 T E 缓冲液（10 m m 〇l/L Tris， I

m m o l /L E D T A ， p H 8.0)。储存于 4°C (见注释 1 和 2)。 2. D N A 聚合酶 I ( 4 U/fxL) (TOYOBO, Osaka)。储存于一20°C 。 3 . 局浓度缓冲液（1 0 X H B ): 0. 5 mol/L Tris-H C l ， p H 7. 4, 100 m m o l / L M g C l2, l m o I/L N a C l , 1 0 m m o l /L D T T 。储存于一20。。。 4. d C T P [a] S ， d G T P [ 〇： ] S (A m e r s h a m )，储存于一20°C 。 5_ d d A T P ， d d T T P (A m e r s h a m)，储存于一20°C 。 6. R A D 储液：混合 130 ML I O X H B ， 13JUL I mol/L D T T ， 30 fxL I m m o l / L d d A T P ， 30 I m m o l / L d d T T P ， 24 ；xL 10 m m o l / L d C T P [a] S 和 24 /xL 10 ( n m o l / L d G T P [a] S 。分装储存于一20° C 。 7•大口径吸头：切除0.2 m L 吸头约5 m m 长度。 2. 2 限制性酶切和同位素标记 1. (20 U / p L ) (T O Y O B O )。储存于一2(TC (见注释 3)。 2. £ C0R V (20U /ML ) (T O Y O B O )。储存于一20°C (见注释 3)。 3. JVofI 添加物： 0.5 mol/L N a C U 20 m m o l / L M g C l 2, 0.065% 牛血清白蛋白 (BSA)， 0• 065% Triton X-100， 4 m m o l / L D T T 。混合 100 |uL 5 mol/L NaCl, 20 pL I mol/L MgCl2, 65 ML 1%BSA, 6.5 10% Triton X-100, 4 fxL I mol/L D T T 和 805 fxL H20 。储存于一20°C。 4. [〇r32P ] d C T P (3000 Ci/m m o l ; A m e r s h a m )。 5. [Qr32P ] d G T P (3000 Ci/m m o l ; A m e r s h a m )。 6 . 测序酶乂《 2.0(12 11//^ ; 1 1 3 8 ，（：1以打1紐(1)。储存于一20。 ( ：。 7•终止液： 5 0 m m o l /L E D T A ， p H 8 , 含 5 0 % 蔗糖和〇.5 % 溴酚蓝（ B P B ) 及二甲苯蓝（xylene cyan〇l, X C )。储存于室温

###2 限制性酶切和同位素标记

###3 二维电泳

3.1 一向电泳（1st D)

制备凝胶和原位消化所需要的装置如图2所示。

用于圆盘琼脂凝胶制备和原位消化的小型仪器设备。

1•用于分离1〜5 k b 片段的第一向电泳缓冲液（10 X Boyer buffer): I mol/L Tris, 0.4 mol/L 乙酸钠， 0.36 mol/L NaCl, 40 m m o l / L E D T A ， p H 8.15。 I. 8 L H 2O 溶解 242 g Tris， 109 g 三水（合）乙酸钠， 42 g N a C l，和 23. 4 g E D T A N a 2 • 2H 20 ，用乙酸（IXbuffer 的 p H 为 8. 0 5 ) 调节 p H 至 8.15。用 0.45 硝酸纤维素膜过滤并储存于室温。 2•用于分离5〜12 k b 片段的第一向电泳缓冲液（10 X marathon T B E buffer): 1.35 mol/L Tris， 0.45 mol/L 硼酸， 0.1 m m o l /L E D T A ， p H 8.8。 1.8L H 2O 溶解 327 g Tris, 55. 6 g 硼酸， 0 •74 g N a 2E D T A . 2H 20 , 用 0 •45 pan 硝酸纤维素膜过滤并储存于室温。 3 . 琼脂糖浓缩胶（0.6%): 2_ 5 g 蔗糖， 0_ 3 g Seakem Gold 琼脂糖（ FMC)， 5 m L 相应的 I O X —向电泳缓冲液（ Boyer或 marathon TBE)，加至 40 mL H2O 中。微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量的温水至起始重量。当温度降至 65°C ，用 0 •45 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 15 mL Falcon离心管每管分装5 mL。储存于 4°C 。 4. 1〜5 k b 片段的琼脂糖分离胶（0 •9%): 10 g 蔗糖，〇• 9 g Seakem Gold琼脂糖 (F M C )， 0. 9 g Seakem GTG 琼脂糖（ F M C ), 20 mL IOXBoyer 电泳缓冲液，加水至200 mL。微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量温水至起始重量。当温度降至65°C ，用 0 •45 ^ x m 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 50 mL Falcon离心管每管分装30 mL。储存于4°C (见注释4)。 5. 5〜12 k b 片段的琼脂糖分离胶（〇.7%): I O g 鹿糖， 0.4 g Seakem G o l d琼脂糖 (F M C ) ， I g Seakem G T G 琼脂糖（ F M C )， 20 m L IOXmarathon T B E 电泳缓冲液，加水至200 mL。微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量温水至起始重量。当温度降至65°C , 用 0.45 p m 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 50 m L F a l c o n 离心管每管分装30m L。储存于4°C (见注释4)。 6•有双滴定管夹的固定架。 7 . 注射器（I m L 和 6 m L )。 8•针头（10 c m 长， 1 9 目，平头）。 9 . 三通管：配注射器。 10• 桂胶管（内径 3 m m 和 5 mm)。 11.去头的吸头：切除 0.2 m L 吸头距头5 m m ，距尾部分，配注射器用。 12•DNA分子质量标准：混合 3 //L l k b l a d d e r (500 ng/ML ; NEB)， 3 0 fzL终止液， 6 7 ML H 20 。储存于 4°C 。

3.2 原位限制性内切酶消化
2 . 3 . 2 原位限制性内切酶消化 1. B P B 溶液（0.01%)。储存于室温。 2 . 反应管： 36 c m 长，内径 2. 7 m m 的 Teflon管接到 3 c m 长的硅胶管（内径 3 m m )。管上做好连续的号码标签。 3. HinfI 缓冲液（10X ): 200 m m o l / L Tris-H C l ， p H 8.3， I mol/L NaCl, 100 m m o l /L M g C l 2， 10m m o l /L D T T 。储存于一2(T C 。

2 . 3 . 2 原位限制性内切酶消化 1. B P B 溶液（0.01%)。储存于室温。 2 . 反应管： 36 c m 长，内径 2. 7 m m 的 Teflon管接到 3 c m 长的硅胶管（内径 3 m m )。管上做好连续的号码标签。 3. HinfI 缓冲液（10X ): 200 m m o l / L Tris-H C l ， p H 8.3， I mol/L NaCl, 100 m m o l /L M g C l 2， 10m m o l /L D T T 。储存于一2(T C 。

3.3 二向电泳（2n d D )

###4 放射自显影
$2 . 4 放射自显影 1 . 干胶仪： BioHRad 583或同类型设备。 2 . 滤纸： 35〇 11\43〇 11， 0.7 111111厚。（层析纸>1〇. 526，八如311^(： 11， 1'〇 1^〇)。 3•塑料保鲜膜（50 c m 宽）。 4. X 射线胶片（35 c m X 43 c m ): FujiRx-U , Kodak BioMax M S 或同类产品。 5 . 增感屏（35 c m X 43 c m ): Fujifilm G R E N E X H R -12 ， Kodak BioMax M S 或同类产品。 6. 3 5 Cm X 4 3 c m 胶片的曝光盒。 7. X 射线胶片洗片机$

##二、方法

###1.偶发性损伤修复（「封闭」，「blocking」)

3 . 1 偶发性损伤修复（“封闭”，“blocking”} 1 . 熔化 RAD储存液，配制封闭液：每个DNA样本混合〇.3 piL DNA聚合酶I 和 1.8 pL RAD储液。用移液器轻柔混合，置于冰上（勿振荡）。 2•加2.1斗 R A D 封闭液到7 斗 D N A (〜2 吨）中。用带粗吸头的移液器轻轻混合。 16°(：孵育 3〇 111丨 11后，再 65。 ( ：孵育3〇 111丨11(见注释1)

3 . 1 偶发性损伤修复（“封闭”，“blocking”} 1 . 熔化 RAD储存液，配制封闭液：每个DNA样本混合〇.3 piL DNA聚合酶I 和 1.8 pL RAD储液。用移液器轻柔混合，置于冰上（勿振荡）。 2•加2.1斗 R A D 封闭液到7 斗 D N A (〜2 吨）中。用带粗吸头的移液器轻轻混合。 16°(：孵育 3〇 111丨 11后，再 65。 ( ：孵育3〇 111丨11(见注释1)

###2.限制性酶切消化和同位素标记

###3.双向电泳

在建立当前的一向电泳操作程序过程中经历了大量的试验摸索。过去放射效应研究基金会（Radiation Effects Research Foundation) 的生化遗传学计划（The BiochemicalGeneticsProgram) 曾广泛地使用了圆盘凝胶电泳系统进行蛋白质突变体的研究，现在这种技术被用于 D N A 上。经过多次试验，我已经在内径 2. 4 m m 的 Telflon 管中进行琼脂糖圆盘凝胶电泳并得到了最好的结果。我发现由于管内壁不平整，可使得在长时间的电泳过程中，琼脂糖凝胶的位置不会移动。凝胶由 I.5 c m 0. 6 % 的浓缩胶和 59 c m 0 •9 % 的分离胶组成。图 3 就是垂直圆盘凝胶装置。这种装置可以同时分析 10 个 D N A 样本。垂直圆盘凝胶装置可高精度地分离大分子 D N A片段。此系统大大地减小了电泳的空间，并降低了原位消化需使用的昂贵的限制内切酶的量（原来的系统每个反应需要使用 Hinf I

3.1 一向电泳
3 . 将持胶器的底部伸人分离胶溶液I c m 深，慢慢吸人分离胶溶液至距底部57 cm 处的第一条线（见注释7)。 4 . 吸人后，保持约30s，再转移至有双夹的铁架台上，凝固 lOmin。 5 . 将旋塞右转90°打开左边进口，小心移走管上带旋塞的注射器。 6 . 使用预热的带有平头针头的I m L 注射器灌分离胶至59 o n 处的第二条线。手指轻敲持胶器的上端数次以保证凝胶的表面平整。凝固3min。 7 . 灌浓缩胶溶液至60. 5 c m 处的第三条线。手指轻敲持胶器的上端数次以保证凝胶的表面平整。凝固 lOmin。 8 . 用 I X —向电泳缓冲液充满持胶器。 9 . 通过直径为5 m m 的硅胶塞将持胶器放置于阳极槽中。 1 0 . 加 350 mL I X —向电泳缓冲液于底部槽。 11. 顶部槽置于底部槽上，并注人300 m L I X —向电泳缓冲液（见注释8)

3 . 将持胶器的底部伸人分离胶溶液I c m 深，慢慢吸人分离胶溶液至距底部57 cm 处的第一条线（见注释7)。 4 . 吸人后，保持约30s，再转移至有双夹的铁架台上，凝固 lOmin。 5 . 将旋塞右转90°打开左边进口，小心移走管上带旋塞的注射器。 6 . 使用预热的带有平头针头的I m L 注射器灌分离胶至59 o n 处的第二条线。手指轻敲持胶器的上端数次以保证凝胶的表面平整。凝固3min。 7 . 灌浓缩胶溶液至60. 5 c m 处的第三条线。手指轻敲持胶器的上端数次以保证凝胶的表面平整。凝固 lOmin。 8 . 用 I X —向电泳缓冲液充满持胶器。 9 . 通过直径为5 m m 的硅胶塞将持胶器放置于阳极槽中。 1 0 . 加 350 mL I X —向电泳缓冲液于底部槽。 11. 顶部槽置于底部槽上，并注人300 m L I X —向电泳缓冲液（见注释8)

3.1.1 琼脂糖圆盘凝胶的制备

3. 3.1 .2 电泳 1 . 每条胶上10 含 1 哗放射性同位素标记的D N A (见注释9)。 2 . 每条胶上1〇 juL D N A 分子质量标准（150 ng)。 3 . 所用样品加完后，合上顶部槽盖，并连通电极和电源。 4•恒压电泳。小 D N A 片段（1〜5 k b ), 130 V ， 19 h 后 140 V ， 24 h (约 5800 V • h) 直M 溴酚蓝条带迁移了 50 c m 。对于大的D N A 片段（5〜11 kb), 70 V 电泳1 周（约 11 200 V . h ) 直至染料X C 迁移 50 c m (见注释10)。 3.3.1. 3 原位限制性内切酶消化琼脂糖圆盘凝胶分离的N w I /Ec0R V 消化片段需要用常见的限制性内切酶如扭 nf I 进一步酶切成更小的片段，之后再进行如图1 的第二步分离。图 6 所示为如何回收所需凝胶部分，图 7 为原位消化的步骤。在 Teflon管中进行酶切反应可以大大减少昂贵的内切酶的使用量，并使操作过程更简便，重复性更好。 1 . 关闭电源，拔出电极，揭开顶盖，吸走阴极槽的缓冲液。 2 . 从阴极槽中取出持胶器。用去离子水清洗胶的底部以去除放射性同位素（注意恰当处理具有放射性的废液)。 3 . 将含有D N A 分子质量标准的胶挤入50 m L Falcon离心管中。加人30 inL E B 溶液（ O.Sj^g/m L ) 染胶 20m i n 。在紫外线下观察胶条并拍摄，用通明标尺来记录各条分子质量标准条带之间的距离（见注释11)。 4 . 假设当分子质量标准I k b 和 5 kb D N A 分别迁移至距底部8 c m 和 38 c m 时，距底部7 c m 和 39 c m 之间的32 c m 长度（此部分两端分别含B P B 和 X O 的胶将用于胶内酶切（同理，对于大分子质量的D N A ，包含 5〜12 k b 片段的距底部7〜39 o n 之间的胶也用于酶切）。在持胶器上距胶顶部7 c m 和 39 c m 处做标记。 5•用I m L 配有去头吸头的塑料注射器吸取B P B 溶液，并缓慢通过B P B 溶液挤压凝胶，当蓝色溶液到达第一条7 c m 线处，按 45°用手术刀切除挤出的凝胶。将挤出的39 c m 凝胶转入装有20 m L IXHiraf I 缓冲液的 50 m L Falcon离心管中，当 B P B 溶液到达39 c m 处，按 90°切断凝胶。 6•室温下在I X f f i n f I 缓冲液中平衡凝胶30m i n , 每隔 IOmin更换缓冲液，期间偶尔摇晃离心管。 7•将凝胶连同缓冲液转移至倾斜10°放置的托盘中。 8•在6 m L 注射器前装上去头吸头，并用 3 m m 内径、 3 c m 长硅质套管将枪头连到 2. 7m m 内径、 33 c m 长的 Teflon管上。将胶条小心吸人Teflon管中，并尽量除去凝胶中的缓冲液。 9•力600 p L 含 400 U H i n f I 和 0. 01% B SA 的 IX ffin f工缓冲液到2 m L 圆底离心管，将溶液吸人Teflon管中，使得 Hinf I 混合液浸没凝胶表面。 1〇 •移走注射器，用 3 c m 硅质套管将Teflon管首尾连接成环，放入尼龙袋中置于 37°C 孵育 4 h (见注释12)

3.1.2 电泳

3.1.3 原位限制性内切酶消化

3.2 第二向电泳
3. 3. 2 第二向电泳 3.3. 2.1 制胶在第二向电泳之前至少一天准备凝胶。利用图4 所示系统可同时制备1〇块（33 cm 宽， 46 c m 长和 0.8 m m 厚）凝胶。丙烯酰胺溶液有毒，在凝胶配制过程中，注意戴塑

3.2.1 制胶

3.2.2 电泳

胶手套。 1•仔细清洗玻璃胶板，用剥离硅烷处理倾斜一面的表面。 2•放好装置，并用粘胶带（Scoth 3M ) 密封底部洞口（见注释13)。 3 . 在烧瓶中混合348 g 3 0 % 丙烯酰胺储存液， 504 g 5X T B E , 23.3 g 5 0 % 甘油， 15 g A P S 和 1110 g 水以制备5.15%丙烯酰胺凝胶（ I.25X T B E )。分装到两个 I L 真空烧瓶。我们发现配制试剂时，通过重量比利用量筒测量体积更准确。这种准确性在保证电泳的可重复性方面非常重要。 4•真空泵抽出溶液中的气体，开始时操作要柔和。摇晃烧瓶，抽真空直至没有气泡产生。 5 . 加人 210斗 T E M E D 到 I L 丙烯酰胺溶液中，混合均匀（见注释14)。 6 . 从装置的底部进口通过硅质套管将凝胶溶液立即注人电泳装置中。当溶液到达距玻璃板顶端I c m 处用夹子夹住进口处套管。 7 . 用水饱和的正丁醇封住液面（见注释15)。 8•聚合I h 后，用 I X T B E 代替凝胶上层溶液。 9 . 用保鲜膜封住凝胶的T B E 溶液，室温放置至使用。凝胶在室温下至少稳定放置 5 天。避免凝胶的顶部干掉。 3 . 3. 2. 2 电泳 1 . 融化蓝色连接琼脂糖，将容器置于70°C 的加热板中。 2. Hinf I 消化4h 后，将每一个胶条挤人装有20 m L I X T B E 的 50 m L Falcon离心管中。 3 . 平衡 IOmin后，弃去缓冲液，将凝胶条转移至凝胶上部上样平台中，用尺子拉直胶条，移至平台的边缘。 4 . 用连接琼脂糖堆积凝胶顶部至玻璃板的倾斜处。 5 . 用刮炉将胶条沿胶板滑到玻璃板上。 6 . 在胶条上覆盖足够的琼脂糖，凝固 lOmin，移走平台。 7 . 在每个槽中加人2.5 L I X T B E 缓冲液，移除封洞的胶带，让凝胶和缓冲液接触。 8•接通电极供电，电泳 150 V ， 40h ，直至分子质量标准染料X C 移至 35 c m 处 (见注释16)。 3. 3. 3 放射自显影 1 . 电泳结束后，关闭电源，拔出电极。 2 . 移走电泳缓冲液。 3 . 放平装置，拿走塑料盖板。 4 . 用刮伊缓慢撬开顶部的玻璃板。 5. 在凝胶上放置一块滤纸（35 c m X 43 c m ，比凝胶宽2 c m ) , 轻按使凝胶附于滤纸上，用手术刀切除凝胶的3 c m 部分。 6 . 捏住滤纸的边缘，迅速翻转将凝胶覆盖于干胶器上的另外一张滤纸上（凝胶置于上方)，用保鲜膜覆盖凝胶，尽量避免折痕和气泡。

3.3 放射自显影

###4 图像分析

图 8 所示为 B A L B /c 小鼠的 R L G S 图谱的数字图像。在此方法中，通过放射自显影方法观察末端标记的D N A 片段。点的密度代表 D N A 的拷贝数目。除了来源于性染色体片段和核糖体 D N A 等有多拷贝的片段之外, 一张 R L G S 图谱上的大部分点的密度代表常染色体 D N A 片段的两个拷贝。对基因组突变的检测主要是通过对 D N A 片段长度改变的观察，如插人或缺失或 B 切位点碱基的突变。通过查找只出现在子代而不在亲代出现的新的点，或者在子代只有一半浓度（一个拷贝）而亲代为两个拷贝的点，突变也可以得到鉴定。如果从 iV〇i I 位点到最近的 I 或 &〇 R I 位点的距离发生改变，突变的片段在凝胶上将会发生位移。突变的片段发生位移的情况如图 9 所示。在某些情况下，发生突变的片段未必能在每一块凝胶上发现（尽管可能出现在不同的胶上），如果 Not I 位点发 2kb- 小鼠、图谱图 8 BALB/c小鼠RLGS图谱的数字图像。根据克隆位点的序列信息确定每一维上的片段大小。生缺失或者碱基替代，那么这个点就不会出现在凝胶上。无论如何，正常的点的密度理论上应该减少5 0 % 。现在已有计算机程序来分析复杂的双向电泳图谱。计算机辅助图像分析检测每个点的存在与否以及任何密度上的改变；因此，我们能高效地检测基因组的缺失、扩增、插人、重组。图 1 0 是我们在小鼠研究中检测到的基因突变的例子。 3.5 RLGS用到的其他内切酶内切酶iV〇«I 、 E c o R I 和 H i n f I 的组合，使我们得到了人类和小鼠（以及大鼠) D N A 点最平均分布的图谱。据我们的经验，目前可以用于检测人类和小鼠的最可靠的标记内切酶是 I (我们检测10 000块胶后得出结论）。第二个酶（在标准方法中； E c o R I ) 、 PsfI (O T G C A G ) 和尸加1[ (C A G + C T G ) 也可以使用。至于第三个用于原位消化的酶， M 6〇 I ~undefined G A T C ) 、 B c m H I (G +G A T C C )、 I 、和 P ™ n 都可用（尽管 I 较贵）。这些酶可以随意组合。 R L G S 在其他物种上同样适用，而且如果研究物种的基因组比人类或小鼠小，那么操作更容易。我们已经检测了以下物种: (1) Medaka (—种鱼；基因组大小为 I X 109bp): N o f I 、 E c o R V 、和 Hinf I 组合， (2) Sacchromyces (酵母； 3X 107bp): Hiwdin (A ^A G C T T ; 作为标记内切酶，仅仅

###5 RLGS 用到的其他内切酶
图 9 限制性图谱为等位基因位点的各种空间构象提供可能的解释。 C 标记的片段代表常规等位基因， V I、 V2、 V3 代表突变体。标记的限制性位点： N= JV toI, H= H k f I , E= & 〇RV 。阴影长方形标记代表缺失图 1 0 发生突变的部分位点的特写。箭头所指为检测到的突变位点。突变位点用M标记。在最左栏，突变的杂合子位点消失

图 9 限制性图谱为等位基因位点的各种空间构象提供可能的解释。 C 标记的片段代表常规等位基因， V I、 V2、 V3 代表突变体。标记的限制性位点： N= JV toI, H= H k f I , E= & 〇RV 。阴影长方形标记代表缺失图 1 0 发生突变的部分位点的特写。箭头所指为检测到的突变位点。突变位点用M标记。在最左栏，突变的杂合子位点消失

注意事项

1•完整的高分子质量D N A 是非常黏稠的，很难通过移液器定量。这种情况下，用 E c o R V 消化基因组D N A 。使用5 U 的酶在100 (xL I X 高缓冲液， 37°C 下消化大约 5〜1 0 叫 D N A Ih。加人 5 mol/L N a C l 和 250 fxL乙醇沉淀D N A 。离心回收 D N A ，并溶解在I O O jU L T E 中。通过 0026。测定浓度。同样乙醇沉淀，溶解于 T E 中使其浓度为 300 pg/V U 利用这些部分消化的 D N A 代替高分子质量 D N A 。 2 . 除非特殊说明，所以缓冲液和溶液都是用电阻值为18 M n 的 Milli-Q 水配制。去离子水或者蒸馏水同样可以使用。 3. N E B 生产的内切酶（iVof I 、 E c o R V 和 H i w f I ) 也可使用。所有的酶都储存于没有除霜的一20°C 冰箱。 4•在煮沸前后，称量琼脂糖溶液的重量，以便煮沸后用水补充至原重量。 5 . 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺通常含有金属离子，可以向每升储存液中加人I g 离子交换树脂（ AmberliteIRN-150L) 搅拌过夜达到纯化。每几个月应重新制备新鲜溶液。 6•在同位素标记之前消化物可在4°C 保存数天，但不能冷冻。 7•仔细检查凝胶有无气泡，如果出现，应重新配制。 8 . 理论上，反应的终体积应为21.9 ，但是实际中大约会降低至2 1 斗或更少。 9 . 检查凝胶缓冲液中有无气泡，如果有，则用 I m L 配有平头针头的注射器轻轻吸除。 10. 温度越高，染料和D N A 片段移动得越快，那么电泳时间的长短也不同。如果时间仓促，短片段的电泳可以在130 V , 2h 后改用200〜250 V 。长片段可以在 100 V ， 2〜3h 后加到150 V 。总之，采取低电压会得到更高分辨率和更清晰的斑点。 11. 防止紫外线辐射，需戴安全面具。 12. 在每个离心管上做好标记。 13. 玻璃胶板上避免粘有油脂和灰尘，以免制胶时形成气泡。 14•调节TEMED的量，以便凝胶在灌注后IOmin凝固。

来源：丁香实验

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