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        重组载体的构建及鉴定

        互联网

        6204

        重组载体的构建及鉴定


        引言:根据实验目的,设计需要重组目的基因或RNAi片段,通过生物合成公司合成,需要说明的是设计的每条单链DNA其两端都应有没切位点,以便于重组。

        1. 合成 的 ssDNA ,分别命名:编码链为 Forward ssDNA , 模板链为 Reverse ssDNA , 每1 OD ssDNA 各加33 μl 无菌去离子水溶解,分别取18 μl 进行退火。

        在1.5ml Eppendorf管中依次加入以下试剂

        10× PCR buffer 4μl

        Forward ssDNA 18μl

        Reverse ssDNA 18μl

        总体积 40μl

        混匀,离心集中样品。 90 ℃ 5min ,缓慢冷却至室温。

        2. dsDNA 的双酶切

        dsDNA 的 Hind Ⅲ 和 BamH Ⅰ双酶切

        1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂

        10×Tango buffe r 10μl

        酶1 1 μl

        酶2 1 μl

        dsDNA 20μl

        无菌去离子水 17μl

        总体积 50μl

        (注意: buffe r 的选择要根据你所用的酶1,2来确定,如下表:


        B+(BLUE)

        G+(GREEN)

        O+(ORANGE )

        R+(RDE)

        BUFFER Y+ 1X

        TANGO

        2X
         

        BamH1

        20-5undefined

        100

        20-50

        50-10undefined

        10undefined
        50-100
         

        Hind Ⅲ

        0-20

        20-50

        0-20

        0-20

        50-100

        50-100
         


        BamH1,Hind Ⅲ 在 2XTANGO中活性比其他几种BUFFER中要高,因此我们如果要用BamH1,Hind Ⅲ 做双酶切的话,首选的BUFFER是 TANGO,下面的双酶切中BUFFER 选择也是一样的 )。

        混匀,离心集中样品。 37 ℃ 温育过夜,次日,酚氯仿抽提一次, -20 ℃ 无水乙醇沉淀过夜。再次日, 4 ℃ 10000rp m 离心 10min 。 沉淀用 70 ﹪的酒精洗涤一次, 37 ℃ 烘干,加 200μl 无菌去离子水溶解。

        3 质粒载体 的双酶切。

         

        1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂

        R buffer 5μl

        酶1 1 μl

        酶 Ⅱ 1μl

        空质粒 5μl

        无菌去离子水 38. 5 μl

        总体积 50μl

        混匀,离心集中样品。37 ℃ 温育4h,取10 μl 进行1.0 ﹪ 的琼脂糖凝胶电泳。

        4 pSUPER.basic 双酶切后大片段凝胶回收

        使用BioDev北京博大泰克得 B 型小量 DNA 片段快速胶回收试剂盒,按说明书的步骤回收大片段。

        5 双酶切后的 空载体 与 dsDNA 连接。

        连接体系如下:

        1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂

         

        T4 Ligase buffer 1 μl

        T4 ligase 1 μl

        dsDNA 1 μl

        空质粒 4 μl

        无菌去离子水 3 μl

        总体积 10 μl

        混匀,离心集中样品,16 ℃ 连接过夜。

        6 连接产物的转化

        5lu双酶切dsDNA加入到100ul 感受态细胞(JM109),冰浴30min,42 0 热休克90s,加入400ul无抗的LB ,37 0 ,150rpm,1h,涂平板。37 0

        过夜。

        7 质粒提取。

        8 PCR鉴定。

        注:这些都是我们的工作经验总结,多少次失败后的成功经验,也有好多PCR,双酶切的图片,可惜没有办法上传,如果有什么问题,我们可以交流,QQ27793402,邮箱:yangyang_won@163.com
         

        (责任编辑:大汉昆仑王)
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