构建基于 H V S 的重组载体

构建基于 H V S 的重组载体

材料

试剂
牛 血 清 白 蛋 白（B S A ; 10 % )

细 胞 ： E le ctro m ax D H lO B 细 胞（In vitro g e n ); O M K 细胞

氯 霉 素（50ull/m l)

D M E M 补 充 如 下 物 质 ：

2 m m o l/ L 谷 氨 酰 胺

0.1 % ( m / V ) 碳 酸 氢 钠

20 0U /m l 青 霉 素

20 0U /m l 链 霉 素

胎 牛 血 清（F B S )

葡 萄 糖（2 0 % 和 4 0 % m / V ) 溶 于 P B S 中

以孔径为0.2um 的滤膜过滤。

P p o l 限 制 酶 和 缓 冲 液（Prom ega) .

卡 那 霉 素（25ul/m l)

Lipofectam ine 2000 (In vitrogen )

L B 培 养 基（ p H 7. 5)

1 % ( m/ V ) 蛋 白 胨

0 .5 % (m/V ) 酵 母 提 取 物

0 .5 % (m/v ) 氯化钠

氯 化 镁（l 〇 m m o l/L )

P B S 缓 冲 液

质 粒 ： H V S —— B A C 和 pH V S^Shuttle

Q IA q u ic k 凝 胶 回 收 试 剂 盒

病 毒 悬 浮 缓 冲 液

10 0 m m o I/L T ris-H C l (p H 8. 0)

50m m ol/L N A C l

10 m m o l/L E D T A

仪器

Beckm an SW 27 离 心 机

烧 瓶（75 cm 3)

梯度混合器

L B 琼 脂 培 养 平 板(14 cm )

M axiprep 柱（Q IA G E N )

滚瓶

方法

1•将外源基因表达片段（包含合适的启动子、基因片段、多聚腺苷酸化信号）插入到穿梭质粒p H V S ——Shuttle中。

2 . 用 I-P p 0I 酶切，将这个基因的表达框和卡那霉素抗性基因片段从p H V S —— S h u t t le 上分离出来。

I - PpoI 酶切反应是在加入IX B S A 和 1 0 mmol/L MgCl2 的 l X I - PpoI 酶切缓冲液中进行。

3 . 依照产商说明书，用 Q I A q u i c k 凝胶回收试剂盒纯化目的片段。

4 . 用 5〜IOul 的 1-PpoI 酶 切 使 得 H V S ^B A C 线性化。

5.65°C 处理 2 0 m in , 热失活对穿梭质粒和 HVS^BAC 的酶切。

6•将 H V S ^B A C 的酶切产物在蒸馏水（d H 20 ) 中透析 2 h 。

7 . 连接线性化的 H V & B A C 和穿梭质粒片段，标准条件下 16°C 连接过夜。

3 ul 的 H V S ^ B A C 与 I f I 的穿梭质粒酶切片段，在 IO fJ 的连接体系中进行连接，按照这样的比例通常可以得到较好的结果。具体的量可以根据提纯的 D N A 的质量和数量而定。

8 . 将连接产物在蒸馏水（d H 20 ) 中透析 2 h 。

9•用电穿孔法将无盐的连接产物导人到 20ul 的 E lectrom ax D H lO B 菌体中。

10.加人 400W 的 L B 培养液，使菌体复苏。

11.37°C 下，摇 晃（lOOr/m i n ) 孵育 l h 。

12.将电转导后的细胞涂在含有 L B 琼脂培养基、卡 那 霉 素（50ug /m l ) 和氯霉素(25 ug/m l ) 的 平 板 （直 径 M c m ) 上，过夜。

I3•按照产商提供的低拷贝质粒的提取方法，用 M a x i p r e p 柱从形成的菌落中提取和纯化重组的 H V S ^ B A C D N A 。

14.按照产商说明，用 Lipofectamine 2000 将 2 哗 的纯化 H V S —— B A C D N A 转人到 O M K细胞中。

15•将转染后的细胞在 D M E M 培养基中孵育 4〜5d ，直至出现明显的细胞毒性。

16•使子代病毒释放到胞外的培养液中。

病毒工作储存液的生长

最适于 H V S 病毒裂解感染和生长的细胞系是在含有 1 〇% FB S 的 DMEM 培养基中培养的 OMK 细胞。

17•将 I X l O ⁷ 个细胞接种于 75c m 3 的细胞培养瓶中，使细胞生长至汇合。

18.在 5m l 含 有 2 % F B S 的 D M E M 培 养基中，以每个细胞〇.1 个蚀斑形成单位(0•lpfu/cell) 的感染复数感染细胞。

19.在 37°C 感 染 I h 后 ，吸出培养液。

20.加 人 I O m l 含 有 5 % F B S 的 D M E M 培养基，在 37°C 下培养 4〜5d 。

21.当观察到出现细胞毒性时，释放子代病毒到胞外的培养液中。
HVS 的工作储存液可以 2X10s—— 2 X107pfu/ml 的最终浓度，在一 70℃下长期保存。如仅需中期保存， HVS 能在 4°C 保持稳定。

高滴度病毒的生长和纯化

22.将 约 2 X 10⁸个 O M K 细胞接种于滚瓶中，用含有 10% F B S 的 D M E M 培养基培养。

23•以约 0.5pfu/个细胞的感染复数感染细胞。孵育 4〜5d 。

24•分离细胞，收集细胞培养液。

25.用带 BeckmanSW27 转头的离心机， 4°C 下 ，将悬浮液于 20 000r/m in 离 心 90 min。

26•用病毒重悬缓冲液将沉淀重悬，每两个转瓶约使用 3m l 的重悬缓冲液。 4°C 下过夜。

27.用梯度混合器，准 备 2 0 % 〜4 0 % 的葡萄糖浓度梯度。在浓度梯度中使重悬的病毒分层。

28•用带 Beckman SW27 转头的离心机， 4°C 下 ，于 20 OOOr/m in 离 心 30 min 。

29•收获中间的条带，这条带中包含约 9 0 % 的包装的病毒颗粒。

30•用带 Beckman SW27 转头的离心机， 4°C 下，于 25 OOOr/m in 离心 60 min。用 PBS 重悬沉淀。