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        聚合酶链式反应(PCR)扩增

        互联网

        2036

        材料、设备及试剂
          一、材料
          不同来源的模板DNA。
          二、设备
          移液器及吸头,硅烷化的PCR小管,DNA扩增仪(PE公司),台式高速离心机。
          三、试剂:
          1、10×PCR反应缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris?Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100。
          2、MgCl2 :25mmol/L。
          3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。
          4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
          
        操作步骤
          一、PCR反应
          1. 依次混匀下列试剂
           35μl H2 O
           5μl 10×PCR反应缓冲液
           4μl 25mmol/L MgCl2
           4μl 4种dNTP
           0.5μl 上游引物(引物1)
           0.5μl 下游引物(引物2)
           0.5μl 模板DNA(约1ng)
          混匀后离心5秒。
          2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U),混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
          3. 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分。
          二、电泳
          取10μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
          
        [注意]
          1.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
          2.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
          3.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。

         

        (责任编辑:大汉昆仑王)
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