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        细胞凋亡检测-生化特征的检测方法

        互联网

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        根据调亡的生化特征的检测方法
        一、琼脂糖凝胶电泳
        1)常规的琼脂糖凝胶电泳
        方法一:
        1.收集细胞(5×106)1000r/min,离心5min,去上清。
        2.PBS洗一次,1000r/min,离心5min,去上清。
        3.加细胞核裂解液500μl重悬细胞,50℃水浴,3~5h,不时振摇或37℃过夜。
        4.加0.5ml平衡酚抽提,上下颠倒几次混匀,6000r/min,离心5min。
        5.上清移至另一Ep管,加0.5ml氯仿:异戊醇抽提,上下颠倒几次混匀,6000r/min,离心5min。
        6.上清移至另一Ep管,加50μl的3mol/L乙酸钠和2ml预冷无水乙醇,上下颠倒几次混匀,可见絮状白色沉淀物。
        7.置液氮5~10min,12 000r/min离心10min沉淀DNA,去上清,真空抽干或风扇下吹干残存液体。
        8.加50~100μl TE缓冲液,另加5μl RNase,37℃水浴30min。
        9.取20μl加上样缓冲液2~5μl,1%琼脂糖凝胶电泳(电压50V,1.5~2h),UV下观察。
        方法二:
        1.离心收集细胞(5×106),PBS(无Ca2+和Mg2+)洗1~2次。
        2.0.5ml TBE溶液重悬,37℃孵育30min。
        3.1mg/ml蛋白酶K 37℃处理30min。
        4.加入上样缓冲液0.1ml。
        5.25μl上样,1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,2V/cm 6h。

        方法三:
        1.收集细胞悬液(106细胞),低速离心(1000r/min,离心5min)。
        2.去上清,沉淀加0.4ml低渗缓冲液作用1h。
        3.13 000r/min,离心10min,将上清转移至另一Eppendorf管中,加等量50%异丙醇和0.5mol/L NaCl混匀,置液氮5min。
        4.12 000r/min,离心10min,弃上清,沉淀真空抽干。
        5.加TE 100μl,65℃加热10min,取20μl,加1~2μl上样缓冲液,电泳观察。

        方法四:
        1.收集细胞,1000r/min离心5min,去上清。
        2.用冰预冷的70%乙醇固定,可长期保存于-20℃冰箱。
        3.1000r/min离心5min,去除固定液,用约0.5ml的PBS重悬细胞。
        4.转入Eppendorf管中,同法离心,去上清。
        5.细胞用40μl PC缓冲液重悬,室温30~60min。
        6.1000r/min离心5min,吸上清于新的Eppendorf管中,真空浓缩15min。
        7.加入0.25% NP-40溶液3μl,1mg/ml RNase A溶液3μl,37℃,30min。
        8.加入3μl蛋白酶K,37℃,30min。
        9.加入12μl样品稀释液,含溴化乙锭的1.5%琼脂糖电泳,观察。

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