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        细胞凋亡检测:生化特征的检测方法

        互联网

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        根据调亡的生化特征的检测方法

        一、琼脂糖凝胶电泳

        1)常规的琼脂糖凝胶电泳

        方法一:

        1.收集细胞(5×106)1000r/min,离心5min,去上清。

        2.PBS洗一次,1000r/min,离心5min,去上清。

        3.加细胞核裂解液500μl重悬细胞,50℃水浴,3~5h,不时振摇或37℃过夜。

        4.加0.5ml平衡酚抽提,上下颠倒几次混匀,6000r/min,离心5min。

        5.上清移至另一Ep管,加0.5ml氯仿:异戊醇抽提,上下颠倒几次混匀,6000r/min,离心5min。

        6.上清移至另一Ep管,加50μl的3mol/L乙酸钠和2ml预冷无水乙醇,上下颠倒几次混匀,可见絮状白色沉淀物。

        7.置液氮5~10min,12 000r/min离心10min沉淀DNA,去上清,真空抽干或风扇下吹干残存液体。

        8.加50~100μl TE缓冲液,另加5μl RNase,37℃水浴30min。

        9.取20μl加上样缓冲液2~5μl,1%琼脂糖凝胶电泳(电压50V,1.5~2h),UV下观察。

        方法二:

        1.离心收集细胞(5×106),PBS(无Ca2+和Mg2+)洗1~2次。

        2.0.5ml TBE溶液重悬,37℃孵育30min。

        3.1mg/ml蛋白酶K 37℃处理30min。

        4.加入上样缓冲液0.1ml。

        5.25μl上样,1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,2V/cm 6h。

        方法三:

        1.收集细胞悬液(106细胞),低速离心(1000r/min,离心5min)。

        2.去上清,沉淀加0.4ml低渗缓冲液作用1h。

        3.13 000r/min,离心10min,将上清转移至另一Eppendorf管中,加等量50%异丙醇和0.5mol/L NaCl混匀,置液氮5min。

        4.12 000r/min,离心10min,弃上清,沉淀真空抽干。

        5.加TE 100μl,65℃加热10min,取20μl,加1~2μl上样缓冲液,电泳观察。

        方法四:

        1.收集细胞,1000r/min离心5min,去上清。

        2.用冰预冷的70%乙醇固定,可长期保存于-20℃冰箱。

        3.1000r/min离心5min,去除固定液,用约0.5ml的PBS重悬细胞。

        4.转入Eppendorf管中,同法离心,去上清。

        5.细胞用40μl PC缓冲液重悬,室温30~60min。

        6.1000r/min离心5min,吸上清于新的Eppendorf管中,真空浓缩15min。

        7.加入0.25% NP-40溶液3μl,1mg/ml RNase A溶液3μl,37℃,30min。

        8.加入3μl蛋白酶K,37℃,30min。

        9.加入12μl样品稀释液,含溴化乙锭的1.5%琼脂糖电泳,观察。


        2)琼脂糖凝胶电泳的定量检测

        简易末端标记法

        1.按常规提取细胞DNA。
          2.在0.5ml的EP管中加入细胞DNA,反应体系如下:细胞DNA 0.5~1.0μg,10×缓冲液2μl,32P-dATP(或-dCTP)0.5μCi,Klenow聚合酶5U,双蒸水加至20μl。
          3.混匀后稍加离心,室温反应30min。
          4.加1μl 0.5mol EDTA终止反应。
          5.常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次,无水乙醇沉淀DNA,真空抽干。
          6.溶于20μl的TE缓冲液中。
          7.取标记DNA在1.8%琼脂糖凝胶上点样,50V电泳约2h。
          8.电泳后的凝集置滤纸上烘干,进行放射自显影。
         
        5’末端32P标记法

        细胞DNA的提取

        1.细胞悬液离心后,沉淀加消化缓冲液0.5ml,50℃ 3~5h,或37℃过夜。
          2.用等体积的酚:氯仿:异戊醇抽提细胞裂解液。
          3.将水相转移至新的试管,加入150mmol/L乙酸钠和10mmol/L氯化镁。
          4.加入2倍体积的预冷无水乙醇,置液氮5min或-20℃ 12h。
          5.12 000r/min离心沉淀DNA,70%乙醇洗1次后,真空抽干。
          6.溶于20μl的TE缓冲液中。
          7.加入终浓度为10μg/ml RNase,37℃,30min。
          8.同法用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提,乙醇沉淀,真空抽干。
          9.溶液20μl的TE缓冲液中,-20℃保存备用。DNA含量测定:用260nm波长紫外分光光度计:吸光单位为20时约为1mg/ml DNA。 

        DNA 5’末端脱磷酸

        1.取纯化的细胞DNA 10μg,然后加入:10×CIP 2μl(1U),双蒸水加至50μl。
          2.37℃水浴2h。
          3.90℃水浴5min以灭活CIP。
          4.用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提,乙醇沉淀,真空抽干。

        DNA 5’末端32P标记

        1.将脱磷酸样品DNA置冰浴上,再加双蒸水10μl,10×缓冲液2μl,T4多核苷酸激酶10U,32P-ATP 740kBq(20μCi),双蒸水加至20μl。
          2.混合后,37℃水浴60min。
          3.加入1μl的0.5mol/L EDTA,90℃灭活5min。


        观测

        1.取一定量的标记DNA稀释后在1.8%琼脂糖凝胶上点样,50V电泳约2h。
          2.电泳后的凝胶置滤纸上烘干,进行放射自显影。
          3.含32P标记DNA电泳干凝胶进行同位素液闪测定,计算放射活性。

        二、原位末端标记技术 

         1)DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移(ISNT)

        1.切片常规脱蜡,梯度乙醇复水化。
          2.将切片组织浸入2×SSC液中,80℃,20min,然后蒸馏水冲尽。
          3.0.5%胃蛋白酶(pH2.0)37℃消化0~20min,PBS洗尽。
          4.用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液A,5min。缓冲液A:50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L MgCl2, 10mmol/L β-巯基乙醇,0.005%BSA,pH7.5。
          5.弃去缓冲液A,滴加标记液约50μl,25℃温育1h。标记反应液:0.005mmol/L dNTP, 0.005mol/L biotin-16-dUTP, 25U/ml Klenow大片段。
          6.PBS漂洗2次,各3min。
          7.内源酶阻断剂阻断15min。
          8.PBS洗2次,各3min。
          9.滴加HRP-avidin覆盖组织,室温下30min。
          10.  PBS洗2次,各3min。
          11.  DAB-H2O2显色约5min。
          12.  流水冲洗后,苏木素复染1min。常规脱水,透明,封片。
          13.  阴性对照片在第5步改加不含Klenow的标记液,余同。 

        2)TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)

        1.切片常规脱蜡,复水,后续过程在湿盒内进行。
          2.3%的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶30min。
          3.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
          4.切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。
          5.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
          6.蛋白酶K或胃蛋白酶消化0~20min。
          7.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
          8.TdT缓冲液孵育10min。
          9.TdT反应液37℃孵育1h。
          10.  切片浸泡在2×SSC溶液10min,以终止反应。
          11.  0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
          12.  链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育30min。
          13.  0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
          14.  0.04%的DAB显色5~10min,镜下控制时间。
          15.  苏木素复染3~5min,常规复水,透明和封片。

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