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        细胞凋亡检测:生化特征的检测方法

        互联网

        1434

         

        根据调亡的生化特征的检测方法

         

        一、琼脂糖凝胶电泳

         

        1 )常规的琼脂糖凝胶电泳

         

        方法一:

        1. 收集细胞( 5 × 106 1000r/min ,离心 5min ,去上清。

        2. PBS 洗一次, 1000r/min ,离心 5min ,去上清。

        3. 加细胞核裂解液 500 μ l 重悬细胞, 50 ℃水浴, 3 5h ,不时振摇或 37 ℃过夜。

        4. 0.5ml 平衡酚抽提,上下颠倒几次混匀, 6000r/min ,离心 5min

        5. 上清移至另一 Ep 管,加 0.5ml 氯仿:异戊醇抽提,上下颠倒几次混匀, 6000r/min ,离心 5min

        6. 上清移至另一 Ep 管,加 50 μ l 3mol/L 乙酸钠和 2ml 预冷无水乙醇,上下颠倒几次混匀,可见絮状白色沉淀物。

        7. 置液氮 5 10min 12 000r/min 离心 10min 沉淀 DNA ,去上清,真空抽干或风扇下吹干残存液体。

        8. 50 100 μ l TE 缓冲液,另加 5 μ l RNase 37 ℃水浴 30min

        9. 20 μ l 加上样缓冲液 2 5 μ l 1 %琼脂糖凝胶电泳(电压 50V 1.5 2h ), UV 下观察。

         

         

        方法二:

        1. 离心收集细胞( 5 × 106 ), PBS (无 Ca2 Mg2 )洗 1 2 次。

        2. 0.5ml TBE 溶液重悬, 37 ℃孵育 30min

        3. 1mg/ml 蛋白酶 K 37 ℃处理 30min

        4. 加入上样缓冲液 0.1ml

        5. 25 μ l 上样, 1.5 %的琼脂糖凝胶上电泳, 2V/cm 6h

         

         

        方法三:

        1. 收集细胞悬液( 106 细胞),低速离心( 1000r/min ,离心 5min )。

        2. 去上清,沉淀加 0.4ml 低渗缓冲液作用 1h

        3. 13 000r/min ,离心 10min ,将上清转移至另一 Eppendorf 管中,加等量 50 %异丙醇和 0.5mol/L NaCl 混匀,置液氮 5min

        4. 12 000r/min ,离心 10min ,弃上清,沉淀真空抽干。

        5. TE 100 μ l 65 ℃加热 10min ,取 20 μ l ,加 1 2 μ l 上样缓冲液,电泳观察。

         

         

        方法四:

        1. 收集细胞, 1000r/min 离心 5min ,去上清。

        2. 用冰预冷的 70 %乙醇固定,可长期保存于- 20 ℃冰箱。

        3. 1000r/min 离心 5min ,去除固定液,用约 0.5ml PBS 重悬细胞。

        4. 转入 Eppendorf 管中,同法离心,去上清。

        5. 细胞用 40 μ l PC 缓冲液重悬,室温 30 60min

        6. 1000r/min 离心 5min ,吸上清于新的 Eppendorf 管中,真空浓缩 15min

        7. 加入 0.25 NP-40 溶液 3 μ l 1mg/ml RNase A 溶液 3 μ l 37 ℃, 30min

        8. 加入 3 μ l 蛋白酶 K 37 ℃, 30min

        9. 加入 12 μ l 样品稀释液,含溴化乙锭的 1.5 %琼脂糖电泳,观察。

         

         

        2 )琼脂糖凝胶电泳的定量检测

         

        简易末端标记法

         

        1. 按常规提取细胞 DNA

        2. 0.5ml EP 管中加入细胞 DNA ,反应体系如下:细胞 DNA 0.5 1.0 μ g 10 ×缓冲液 2 μ l 32 P-dATP (或 -dCTP 0.5 μ Ci Klenow 聚合酶 5U ,双蒸水加至 20 μ l

        3. 混匀后稍加离心,室温反应 30min

        4. 1 μ l 0.5mol EDTA 终止反应。

        5. 常规酚 / 氯仿 / 异戊醇抽提 1 次,无水乙醇沉淀 DNA ,真空抽干。

        6. 溶于 20 μ l TE 缓冲液中。

        7. 取标记 DNA 1.8 %琼脂糖凝胶上点样, 50V 电泳约 2h

        8. 电泳后的凝集置滤纸上烘干,进行放射自显影。

         

         

        5’ 末端 32 P 标记法

         

        细胞 DNA 的提取

        1. 细胞悬液离心后,沉淀加消化缓冲液 0.5ml 50 3 5h ,或 37 ℃过夜。

        2. 用等体积的酚:氯仿:异戊醇抽提细胞裂解液。

        3. 将水相转移至新的试管,加入 150mmol/L 乙酸钠和 10mmol/L 氯化镁。

        4. 加入 2 倍体积的预冷无水乙醇,置液氮 5min 或- 20 12h

        5. 12 000r/min 离心沉淀 DNA 70 %乙醇洗 1 次后,真空抽干。

        6. 溶于 20 μ l TE 缓冲液中。

        7. 加入终浓度为 10 μ g/ml RNase 37 ℃, 30min

        8. 同法用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提,乙醇沉淀,真空抽干。

        9. 溶液 20 μ l TE 缓冲液中,- 20 保存备用。 DNA 含量测定:用 260nm 波长紫外分光光度计:吸光单位为 20 时约为 1mg/ml DNA

         

         

        DNA 5’ 末端脱磷酸

        1. 取纯化的细胞 DNA 10 μ g ,然后加入: 10 × CIP 2 μ l 1U ),双蒸水加至 50 μ l

        2. 37 ℃水浴 2h

        3. 90 ℃水浴 5min 以灭活 CIP

        4. 用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提,乙醇沉淀,真空抽干。

         

         

        DNA 5’ 末端 32 P 标记

        1. 将脱磷酸样品 DNA 置冰浴上,再加双蒸水 10 μ l 10 ×缓冲液 2 μ l T4 多核苷酸激酶 10U 32 P-ATP 740kBq 20 μ Ci ),双蒸水加至 20 μ l

        2. 混合后, 37 ℃水浴 60min

        3. 加入 1 μ l 0.5mol/L EDTA 90 ℃灭活 5min

         

         

        观测

        1. 取一定量的标记 DNA 稀释后在 1.8 %琼脂糖凝胶上点样, 50V 电泳约 2h

        2. 电泳后的凝胶置滤纸上烘干,进行放射自显影。

        3. 32 P 标记 DNA 电泳干凝胶进行同位素液闪测定,计算放射活性。

        二、原位末端标记技术

         

          1 DNA 聚合酶或 Klenow 大片段介导的原位缺口平移( ISNT

         

        1. 切片常规脱蜡,梯度乙醇复水化。

        2. 将切片组织浸入 2 × SSC 液中, 80 ℃, 20min ,然后蒸馏水冲尽。

        3. 0.5 %胃蛋白酶( pH2.0 37 ℃消化 0 20min PBS 洗尽。

        4. 用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液 A 5min 。缓冲液 A 50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L MgCl2 , 10mmol/L β - 巯基乙醇, 0.005 BSA pH7.5

        5. 弃去缓冲液 A ,滴加标记液约 50 μ l 25 ℃温育 1h 。标记反应液: 0.005mmol/L dNTP, 0.005mol/L biotin-16-dUTP, 25U/ml Klenow 大片段。

        6. PBS 漂洗 2 次,各 3min

        7. 内源酶阻断剂阻断 15min

        8. PBS 2 次,各 3min

        9. 滴加 HRP-avidin 覆盖组织,室温下 30min

        10.  PBS 2 次,各 3min

        11.  DAB-H2 O2 显色约 5min

        12.  流水冲洗后,苏木素复染 1min 。常规脱水,透明,封片。

        13.  阴性对照片在第 5 步改加不含 Klenow 的标记液,余同。

         

         

        2 TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记技术( TUNEL

         

        1. 切片常规脱蜡,复水,后续过程在湿盒内进行。

        2. 3 %的 H2 O2 阻断内源性辣根过氧化物酶 30min

        3. 0.15mol/L PBS 2 次,每次 5min

        4. 切片浸泡在 2 × SSC 80 20min

        5. 0.15mol/L PBS 2 次,每次 5min

        6. 蛋白酶 K 或胃蛋白酶消化 0 20min

        7. 0.15mol/L PBS 2 次,每次 5min

        8. TdT 缓冲液孵育 10min

        9. TdT 反应液 37 ℃孵育 1h

        10.  切片浸泡在 2 × SSC 溶液 10min ,以终止反应。

        11.  0.15mol/L PBS 2 次,每次 5min

        12.  链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育 30min

        13.  0.15mol/L PBS 2 次,每次 5min

        14.  0.04 %的 DAB 显色 5 10min ,镜下控制时间。

        15.  苏木素复染 3 5min ,常规复水,透明和封片。

         

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