• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        细胞凋亡检测:形态学特征的检测方法

        互联网

        2191

         

        根据调亡形态学特征的检测方法

         

        一、普通光学显微镜观察方法

         

        1 )苏木素-伊红染色( HE 染色法)

         

        石蜡组织切片的 HE 染色

        1. 取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋, 4 μ m 切片。

        2. 切片常规用二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗:二甲苯( I 5min →二甲苯(Ⅱ) 5min 100 %乙醇 2min 95 %的乙醇 1min 80 %乙醇 1min 75 %乙醇 1min →蒸馏水洗 2min

        3. 苏木素染色 5min ,自来水冲洗。

        4. 盐酸乙醇分化 30s (提插数下)。

        5. 自来水浸泡 15min 或温水(约 50 ℃) 5min

        6. 置伊红液 2min

        7. 常规脱水,透明,封片: 95 %乙醇( I min 95 %乙醇(Ⅱ) 1min 100 %乙醇( I 1min 100 %乙醇(Ⅱ) 1min →二甲苯石碳酸( 3 1 1min →二甲苯( I 1min →二甲苯(Ⅱ) 1min →中性树脂封固。

         

         

        2 )甲基绿-派诺宁染色法

         

        1. 新鲜取材组织固定液中 4 ℃固定 3 6 小时。

        2. 直接转入 95 %乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。

        3. 切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水。

        4. 置染色液中室温下染片约 1h

        5. 取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液。

        6. 插入丙酮中迅速分化。

        7. 转入丙酮二甲苯( 1 1 )稍洗。

        8. 二甲苯透明 2 3 次。

        9. 中性树胶封固。

         

         

        3 Giemsa 染色

         

        1. 收集细胞( 1 × 106 ), PBS 1 次。

        2. 用细胞涂片离心机制成细胞涂片。

        3. 甲醇固定 3 5min

        4. Giemsa 稀释染色液 15 30min ,冬天在 37 ℃温箱中染色。

        5. 用磷酸盐缓冲液分色,以镜下控制为准。

        6. 涂片晾干后用中性树胶封片。

         

         

        4 )瑞氏( Wright )染色

         

        1. 收集细胞( 1 × 106 ), PBS 1 次。

        2. 用细胞涂片离心机制成细胞涂片。

        3. 甲醇固定 3 5min

        4. Wright 液染色 2min

        5. Wright 磷酸缓冲液稀释液 4 10min ,然后用蒸馏水冲洗。此时如果颜色较深,可 0.08 %醋酸分化数秒钟。

        6. 直立晾干后,用中性树胶封固。

         

         

        二、透射电子显微镜观察方法

         

        1 )透射电镜样本的取材和固定

         

        培养细胞的取材和固定

        1. 常规收集帖壁和悬浮细胞,置离心管中离心, 800 1000r/min 10min

        2. 0.01mol/L PBS 5ml 重悬细胞。

        3. 将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。

        4. 离心, 2000r/min 15 20min ,使细胞成团。

        5. 小心吸去上清,加入 2.5 %戊二醛固定液固定细胞团,以免细胞团散开。

        6. 取出离心管内的琼脂,仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。

        7. 将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中, 4 ℃(可长期)保存。

        8. 0.1mol/L PBS 缓冲液洗 1 次。

        9. 1 %锇酸后固定 30 60min

         

         

        三、荧光显微镜观察方法

         

        1 )吖啶橙染色法

         

        1. 制备活细胞悬液,浓度约为 107 /ml

        2. 95 μ l 的细胞悬液,加 5 μ l 的吖啶橙贮存液混匀。

        3. 吸一滴混合液点洁净玻片上,直接用盖玻片封片。

        4. 荧光显微镜选用激发滤片 BG 12 BV 等,阻断滤片用 515nm SP3

         

         

        2 Hoechst33258 染色法

         

        1. 原代细胞培养,细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。

        2. 细胞固定液 4 ℃固定 5min

        3. 蒸馏水稍洗后,点加 Hoechst33258 染色液, 10min

        4. 蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体。

        5. 封片剂封片后荧光显微镜观察。

         

         

        3 Hoechst33342 染色法

         

        1. Hoechst33342 加入培养的细胞中,终浓度为 10 μ g/ml 37 ℃孵育 30min

        2. 4 %的多聚甲醛和培养液以 1 3 混合,使多聚甲醛的浓度为 1 %,固定细胞 5 10min

        3. 固定好后,将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。

        4. 荧光显微镜激发滤片选用 UV 激发滤片,阻断滤片为 400 500nm

         

         

        以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法,也可先固定后染色:

        1. 收集( 0.5 3.0 )× 106 个细胞, 500 1000r/min ,离心 5min 去上清。

        2. PBS 1 次, 500 1000r/min ,离心 5min PBS

        3. 3 %多聚甲醛 50 μ l 重悬细胞,室温下固定 10min

        4. PBS 1 次, 500 1000r/min 离心 5min PBS

        5. 15 μ l Hoechst33258 33342 重悬细胞,终浓度为 16 μ g/ml ,孵育 15min

        6. 10 μ l 放在玻片上,荧光显微镜下观察,可数 500 个细胞,计算调亡率。

         

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序