大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化

实验概要
大肠杆菌感受态细胞的CaCl ₂ 法制备及质粒转化。

实验原理

处于对数生长期的细菌经CaCl ₂ 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。

转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-，M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl ₂ ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl ₂ 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl ₂ 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl ₂ 法使用更广泛。

主要试剂

1. 0.1mol/L CaCl ₂ 溶液

2. LB液体培养基

3. 30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌

主要设备

1. 超净工作台

2. 冷冻离心机

3. 恒温摇床

4. －70℃冰箱

5. 10mL移液管

6. 吸耳球

7. 1mL、200μL移液枪（配套枪头）

8. 50mL 离心管

9. 1.5mL离心管

实验材料 细胞实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-138-1.html

大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）