CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

互联网2008-07-08

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原理：

转化(Transformation )：将外源DNA 分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。

受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2 、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA 分子得以进入。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。

准备：

1、配制0.05mol/L CaCl2 -15%甘油混合溶液，高温高压灭菌；

注：CaCl2 必须为分析纯以上。

2、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌；

注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。

3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600 =0.5。注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。

实验步骤：

1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。

注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。

2、用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟。

注：（1）洗去细菌碎片和残留的培养液；（2）洗涤时间宜短不宜长。

3、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2 -15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g离心5分钟。

此时可见细菌沉淀为白色，体积也胀大为最初沉淀体积的数倍。

4、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2 -15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。

注：（1）最好在2月之内用完，然后重新制备；（2）若要进一步提高转化效率，可将加入的溶液体积减少到1ml，或分装为200μl/管。

说明：

1、在对比了数种CaCl2 法制备感受态细胞的方法之后，确定此方案是转化效率最高且最简易的方案,其转化效率只比电转化相错1~2个数量级。

2、尽量在超静工作台内操作。