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        植物过氧化物同工酶材料的提取

        互联网

        2058
        一、实验目的
            1、掌握植物同工酶实验技术,了解植物同工酶分析在遗传研究中的作用。
        2、掌握过氧化物同工酶的提取方法。
        二、实验原理
            同工酶指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式,即催化同一种反应而结构不同的一簇酶,它们是受遗传决定的酶的不同分子形式。是 生物 体代谢的调节者,与特殊的生理功能和细胞分化相联系,并且与基因进化及种的演变有着密切的关系,表现出明显的组织、种属和发育的特异性。利用凝胶电泳技术可以比较种属同工酶的差异并将它们分开,用专一的作用底物和特殊染料,把需要分析的酶染色,在凝胶上呈现同工酶谱。
        三、实验材料
        同属的植物叶片
        四、器具及药品
        天子天平,冷冻离心机,冰箱,冷冻匀浆机,可调移液器,解剖器,漏斗,纱布, 离心管 ,研钵,蔗糖,溴酚兰,石英砂,聚乙烯吡咯烷酮(PVP),巯基乙醇,三羟甲基氨基甲烷,盐酸。
        五、实验步骤
        1、预冷研钵、漏斗、 离心管 、纱布等器具。
        2、配制提取缓冲液
        Tris-HCl缓冲液配制:Tris6.057g,加水溶解,用浓盐酸调PH至7.5,定容至500ml,过滤储存。
        25ml 0.1mol/l的PH7.5的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液;1.25g蔗糖;0.025 ml巯基乙醇。即称蔗糖2.5g加入50ml 0.1mol/l PH7.5的磷酸缓冲液中,研磨前加入0.050ml巯基乙醇(0.1% v/v,0.014mol/l)。
        3、研磨
        将预冷的研钵拿出放冰浴中,每一研钵中加少量石英砂、聚乙烯吡咯烷酮,将需研磨的材料剪碎于研钵中,加提取缓冲液1ml,研磨成匀浆,再加4ml提取缓冲液,继续研磨2分钟。
        4、离心
        将研磨材料用漏斗、纱布过滤于1.5ml离心管内,写上标签。平衡后对称放入冷冻 离心机 内,15000rmp/min离心20分钟。
        5、分装保存
             取上清液加入等体积的40%的蔗糖,1-2滴1%溴酚蓝,混匀后分成3瓶,贴上标签,-20℃保存。
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