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        如何用HPLC法测定辣根过氧化物酶中同工酶C的含量?

        相关实验:非同位素标记探针的酶法检测实验

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        dxy_2ui4obdw

        用HPLC法测定辣根过氧化物酶中同工酶C的含量

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        3 个回答

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        晓雨知春来

        有帮助

        你可以按照以下步骤进行:

        1.样品制备: 从辣根组织中提取辣根过氧化物酶。可以使用适当的提取缓冲液(如磷酸盐缓冲液)将辣根样品研磨或切碎,并离心以获得澄清的提取物。

        2.蛋白质定量: 使用合适的蛋白质定量方法(如Bradford法、Lowrv法或BCA法)确定提取物中的蛋白质含量。

        3.样品前处理: 根据实验需求和已有的文献方法,可能需要对提取物进行一些前处理步骤例如蛋白质分离、富集或去除干扰物。

        4.HPLC条件设置: 选择适当的HPLC系统和柱,并根据同工酶C的特性设置合适的分离条件,如流动相、梯度条件、流速等。也可以参考已有的文献方法进行条件设置。

        5.样品注射: 将前处理后的样品以适当的注射体积注入HPLC系统中

        6.检测和分析: 使用合适的检测器

        user-title

        sswei

        有帮助

        操作步骤

        (一)HRP的制备

        ⒈水提取:

        称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP),用菜刀切成小碎块,在搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜。次日用甩干机甩干,收集滤液,碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次,合并两次滤液,量总体积和度。

        ⒉硫酸铵分级分离:

        在不断搅拌下,每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度),大约在1~2小时内加完,置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出,下面浑浊液以3000转/分离心15分钟,弃沉淀,合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌,当硫酸铵全部溶解后,置冷室过夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰冻离心机中以13000转/分离心20分钟,弃去上清液,收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止),分装于透析袋内,放在流动自来水中进行透析1~2天,直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析,中间更换2~3次,用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。

        将透析液合并,在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟;去沉淀,量上清液的体积。

        ⒊丙酮分级分离:

        将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中,在不断搅拌下,用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃的丙酮,放置片刻,在冰冻离心机中以4,000/分离心15分钟,弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)-15℃丙酮,(操作同上),静置后,在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中,透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。

        ⒋精制:

        将上步酶液适当稀释,滴加1M硫酸锌溶液,使酶液中锌离子浓度为10-3M,5000转/分离心10分钟,得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤,离心,洗液与清液合并,分装于透析袋内,对水透析除盐,用微孔滤膜过滤,进行真空冷冻干燥(约得20毫克),产品呈米黄色纤维状松软物,HRP产品的Rz值可达3.0左右,置真空干燥器中低温保存。

        HRP的活力测定

        测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法,以过氧化氢为底物,在酶作用下,连苯三酚可形成红棓酚(Purpurogallin),在430nm处测定产物的形成。用红棓酚值(PZ)表示酶的活力。PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数。


        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        要使用HPLC法测定辣根过氧化物酶中同工酶C的含量,你可以按照以下步骤进行:

        1. 样品制备:从辣根组织中提取辣根过氧化物酶。可以使用适当的提取缓冲液(如磷酸盐缓冲液)将辣根样品研磨或切碎,并离心以获得澄清的提取物。

        2. 蛋白质定量:使用合适的蛋白质定量方法(如Bradford法、Lowry法或BCA法)确定提取物中的蛋白质含量。

        3. 样品前处理:根据实验需求和已有的文献方法,可能需要对提取物进行一些前处理步骤,例如蛋白质分离、富集或去除干扰物。

        4. HPLC条件设置:选择适当的HPLC系统和柱,并根据同工酶C的特性设置合适的分离条件,如流动相、梯度条件、流速等。也可以参考已有的文献方法进行条件设置。

        5. 样品注射:将前处理后的样品以适当的注射体积注入HPLC系统中。

        6. 检测和分析:使用合适的检测器(如UV检测器或荧光检测器)进行同工酶C的检测,并记录峰的面积或高度。根据已有的标准曲线或其他定量方法,将峰面积或高度转化为同工酶C的含量。

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