植物同工酶实验

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一、实验原理

同工酶(isozymes)是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利用凝胶电泳 技术可以将它们分开，用专一的作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上呈现同工酶谱。

二、实验目的

1.通过实验掌握植物 同工酶实验技术，了解植物同工酶分析在遗传学研究中的意义。

2.着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方法。

三、实验材料

以下内容任选一组或二组即可

1.二种不同品种蚕豆。

2.蚕豆的新种子和储藏2—3年陈种子。

3.蚕豆与豌豆。

4.甘蓝和甘蓝型油菜的幼苗嫩叶。

5.不同品种的柑桔嫩叶。

四、实验器具和药品

1.用具：电泳仪 ，电泳槽，注射筒及针头，微量注射器，装凝胶用玻璃管(内径为5毫米、长度为90毫米)、离心机。

2.药品：三羟甲基氨基甲烷(Tris)，四甲基乙二胺(TEMED)，丙烯酰胺(Acr)，甲叉双丙烯酰胺(Bir)，甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝，联苯胺，过氧化氢。

五、实验说明

同工酶的不同分子形式，可以出现在同一生物的不同发育时期，所以取不同期的材料，酶带的情况就不一样。这是同工酶技术适用于发育研究的方便之处。另一方面，利用同工酶技术进行遗传学分析与群体遗传学研究时，则特别要求取材的一致性。否则，它们之间的差异可能不是遗传而是由发育造成的。例如要比较两个品种蚕豆的遗传差别，可用它们的发芽种子进行比较。但这时至少应该检查是否是同年的种子、是否在发芽前都晒过种、是否是同时浸种，是合是恒温发芽，以及是否是取同样部位和同样分量等。

六、实验步骤

(一)不同品种或种间的植物，取发育时期相同，组织相同的样品，制备酶粗提液。一般取样0.5克，或在恒温条件下发芽的幼苗3—5个，置于研钵中，加入0.1毫升—0.5毫升水研磨匀浆、后将样品移至小离心管中离心(3500rpm)15分钟，取上清液，混入等体积的50%的蔗糖溶液，电泳前可在冰箱中保存。

(二)聚丙烯酰胺凝胶系统的配制

A液：1mol/LHCl48.0毫升，Tris36.4克：TEMED0.23

毫升加水至100毫升，pH8.3。

B液：丙烯酰胺28.0克;甲叉双丙烯酰胺0.735克加水至100毫升。

C液：过硫酸铵(用前配制)1.4%。

配胶：A∶B∶C∶H2O=1∶2∶0.4∶4.6

配胶后立即灌好装胶的玻璃管

(三)电极缓冲液配制

Tris30.0克

甘氨酸14.4克

加水至1000毫升、pH8.3、使用时稀释10倍。

(四)染色液配制——过氧化物酶染液

醋酸联苯胺溶液5毫升，3%H2O22毫升，H2O93毫升

(五)加样和电泳

各根凝胶管加入0.05毫升的样品酶粗提液0.05毫升。加一小微滴0.005%溴酚蓝，上下电泳槽加电极缓冲液后在低于15℃气温中，每管电流2mA进行电泳，当溴酚蓝迁至凝胶下端0.5—1厘米时停上电泳。电泳时间3—4小时。

(六)用长针头注射器注水法自凝胶管中取出凝胶，凝胶要完整，不能断裂。

(七)染色：将完整的凝胶条置于中号试管中，加入染色液，浸泡整条凝胶，室温下染色20—30分钟，呈现酶带后取出凝胶，用水漂洗终止染色。

(八)带型清楚的胶应作摄影记录或作扫描测定，胶凉干后还作永久保存(图36-1)。

七、实验结果

1.记录实验的操作程序，检查是否和原设计相符合?

2.将各胶柱中酶带条数、宽度、着色深浅和移动距离填入表中。

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3.选择比较组分胶柱中、着色最深的酶带或特殊酶带(即该组分特有酶带)，计算酶带的相对迁移率Rf值

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