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        植物过氧化物同工酶的电泳技术

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        1251
        一、实验目的
        学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法,掌握过氧化物酶的电泳、染色技术和分析方法。
        二、实验原理
            同工酶指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式,即催化同一种反应而结构不同的一簇酶,它们是受遗传决定的酶的不同分子形式。是生物体代谢的调节者,与特殊的生理功能和细胞分化相联系,并且与基因进化及种的演变有着密切的关系,表现出明显的组织、种属和发育的特异性。利用凝胶电泳技术可以比较种属同工酶的差异并将它们分开,用专一的作用底物和特殊染料,把需要分析的酶染色,在凝胶上呈现同工酶谱。
        三、实验材料
            实验10所提取的材料
        四、器具及药品
           恒温培养箱, 冰箱,天子天平,微量进样器,电泳仪,电泳槽,长针头注射器,烧杯,移液管,琼脂,三羟甲基氨基甲烷,盐酸,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,甘氨酸,过硫酸铵,联苯胺,过氧化氢,四甲基乙二胺(TEMED),硫酸锰,醋酸钠,愈创木酚。
        五、实验步骤
        1、 仪器 组装
             将玻璃板插入胶条内,再插入电泳槽内,注意,高玻璃对红电极,矮玻璃对黑电极,拧紧螺丝。
        2、封胶
        配制1%的琼脂密封胶条。
        3、加分离胶
        按下列配方配制分离胶:
        30%Acr-0.8%Bis 4.5ml,1mo/lTris-HCl缓冲液(PH8.8)15ml,1%过硫酸铵0.5ml,TEMED
        20ul。混匀后加到两块玻璃之间,高度至标记处,大概距矮玻璃1cm左右,随后注入 蒸馏 水,水面与矮玻璃持平。
        4、加浓缩胶
        分离胶凝固后(水与胶间出现明显界线时),吸去上层水,配浓缩胶,配方如下:
            30%Acr-0.8%Bis 1.3ml,1mo/lTris-HCl缓冲液(PH6.8)1.3ml,重蒸水7.1ml,1%
        过硫酸铵0.3ml,TEMED15ul。将配好的浓缩胶混匀后加到分离胶之上,与矮玻璃持平。
        5、插梳子
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