免疫荧光染色实验方法

（一）制片
选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。

（二）固定
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。

标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
表 常用抗原物质的固定方法

抗原物质		固定剂		固定条件（min）
蛋白质抗原		95%～100%乙醇		室温3～10
酶、激素		丙 酮		4℃ 30
免疫球蛋白		四氯化碳
病 毒		丙酮、四氯化碳、无水乙醇		室温5～10或4℃ 30～60
多糖、细菌等		微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮		室温5～10或4℃ 30～60
类 脂 （异嗜性抗原）		10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol）		室温3～10

（三）水洗
固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

（四）染色
染色分直接染色法与间接染色法。
1. 材料与 试剂
（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。
（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液
（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。
（4）带盖方盘
2.直接染色法
（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。
（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。
（3） 蒸馏 水冲洗。
（4）滴甘油缓冲液一滴，封片， 荧光显微镜 检查。
3.间接染色法
（1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H ₂ O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
（2）检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。

（五）结果显示
荧光显微镜 所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。
荧光强度的表示方法如下：
＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。
＋＋ ：荧光明亮，呈黄绿色。
＋ ：荧光较弱，但清楚可见。
± ：极弱的可疑荧光。
－ ：无荧光。

（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。
保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（Fluormount）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。