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        自我总结的Westen Blot步骤,简单实用!

        丁香园论坛

        3520
        自我总结的Westen Blot步骤,简单实用!

        蛋白质的提取
        (整个过程冰上进行)
        一.组织膜蛋白

        裂解液 bufferA+1%蛋白酶抑制剂
        蛋白保存液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
        1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中(研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗,用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨(研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗,用纸吸干水)
        2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心,1500转15min
        3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中(离心管事先用去离子水冲洗)用裂解液配平
        4.差速离心33000-35000转(45000g)30min
        5.弃上清,沉淀加入150μl左右蛋白保存液(根据沉淀的量调整)用枪来回吹打使沉淀溶解,枪头在液面下,尽量不要出沫
        6.将上述液体分装到0.5ml离心管中,每管20-25μl,留一管-20°C保存测浓度,其余放入-80°C保存
        二.组织总蛋白

        裂解液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
        1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中(研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗,用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨(研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗,用纸吸干水)
        2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心,13500转30min
        3.取上清分装到0.5ml离心管中,每管20-25μl,留一管-20°C保存测浓度,其余放入-80°C保存
        三.细胞总蛋白

        裂解液 RIPA+1%蛋白酶抑制剂
        1.将培养瓶中培养液倒掉,加入PBS冲洗5-6遍,倒掉PBS,用枪吸出倒不尽的PBS
        2.每瓶加100-150μl裂解液,用细胞刮刀尽量将细胞刮下来(刮刀用前去离子水冲洗,用纸吸干水,用完一样处理)用200枪转入1.5ml离心管中
        3.超声破碎细胞,频率80-100间,超声探头(用前用纸擦,用后用纸擦并盖上盖)插入液面下,超声3-5s停3-5s,总共20s左右,停止5min左右
        4.重复上步4-6次
        5.4°C离心13500转15min
        6.取上清分装到0.5ml离心管中,每管40μl,留一管-20°C保存测浓度,其余放入-80°C保存。

        蛋白质浓度的测定
        工作液(BCA试剂B液:BCA试剂A液=1:50)
        1.用100枪将19μl PBS加入96孔板(两边不加,测浓度不准)
        2.用2.5枪加入1μl待测样品(加样时枪头在液面下,提抢时贴壁,尽量不产生气泡)
        3.用200枪加入200μl工作液,混匀(枪头在液面下,不产生气泡)
        4.放入37°C孵箱30min
        5.用酶标仪测浓度,记录数据

        凝胶的配置
        一.  分离胶的配置:
        1.  将胶板用自来水冲洗干净(否则配出的胶会不均匀),用去离子水冲洗。将胶板固定在架子上,加入去离子水至矮板高度,等待3~4分钟,测试是否漏水。期间可以准备配胶时所需要的溶液:
        去离子水:室温放置
        30%丙烯酰胺:4℃放置,神经毒性
        TRIS—HCL(ph8.8):4℃放置
        TRIS—HCL(ph6.8):4℃放置
        10%SDS(自配):室温放置
        10%AP(现配现用):避光
        TEMED:室温放置,神经毒性
        2.  根据所需蛋白质的分子量确定所要配制多大浓度的胶。本实验采用的胶为10%的分离胶,2块胶版配置25ml即可。按照如下的量进行配制分离胶:
        去离子水:9.9ml
        30%丙烯酰胺:8.3ml
        TRIS—HCL(ph8.8):6.3ml
        10%SDS(自配):0.25ml
        10%AP(现配现用):0.25ml
        TEMED:0.01ml
        配置时要将液体混匀,加入最后两种物质的速度要快,因为丙烯酰胺是促凝剂,凝聚的物质为APH和TEMED。将配好的分离胶倒入胶板中(倒入量为胶板高度的3/4)加入去离子水封住,防止空气进入,排除气泡。加去离子水时要轻,防止将上层的分离胶稀释。通常分离胶需要30~35分钟即可,凝固后可以看到用一条直线。
        3.  在配好的分离胶上层加入TRIS—HCL(ph6.8)作为一种缓冲,因为积层胶用的是TRIS—HCL(ph6.8)。然后配制积层胶:
        去离子水:5.5ml
        30%丙烯酰胺:3.5ml
        TRIS—HCL(ph6.8):1.5ml
        10%SDS(自配):0.08ml
        10%AP(现配现用):0.08ml
        TEMED:0.008ml
        配好后将TRIS—HCL倒出,倒入积层胶,插入梳子(梳子要用去离子水冲洗干净,并将去离子水甩掉,否则会在胶板上留下不能用的孔道),插梳子的时候要排除气泡,从一端向另一端推。20分钟即可凝固,拔出梳子。
        将配好的胶板放入装有去离子水的饭盒中,防止胶中的水分蒸发,发生缩胶现象。

        电泳液和转膜液的配制
        1.  电泳液:Gly15.0g,Tris-base3.02g,SDS1g,1000ml 去离子水,室温保存
        2.  转膜液:Gly14.4g,Tris-base3.00g,甲醇100ml,900ml去离子水,4℃保存

        蛋白质样本的处理
        1.  从-80℃冰箱中取出提好的蛋白质,按照算好的蛋白,ripa,loading将蛋白稀释到同一个体积。(此操作过程在冰域中进行)
        蛋白质的体积 X= 40μg/[(1.348undefinedOD值-0.0799)20~Q~Kbr_~H~M~2~1Ripa的体积 Y=体积最大的蛋白质补整-X
        Loading的体积Z=1/4(X+Y)
        2.  煮样:100℃,5min。(将管外的水擦干净)

        电泳过程
        1.  将电泳槽准备好,胶板的矮面朝里,加入电泳液,先在里面和外面个加入一半的电泳液,排净气泡后加满。
        2.  上样,上样量为8μl。上样时要慢,如果担心样的中央处有凹陷,那就在边处让样流下。
        3.  按照“红对红,黑对黑”的原则安装电极。开始跑电泳。先恒压70v使蛋白质跑到同一条起跑线上,待跑至分离胶上时,改为100v,使溴酚蓝全部跑出时停止。电压越小跑的越好。

        转膜过程
        1.剪好滤纸和NC膜,滤纸要比膜小1~2cm,在转膜液中浸泡。
        2.准备白色的矮一些的盒子,里面装好转膜液,将膜取下,取得过程中要注意不要将膜弄破。
        3.制作“三明治”,夹板黑色的一面朝向桌子,第一层为海绵,第二层为滤纸,第三层为胶,第四层为滤纸,这时不要急于将最后一层海绵盖上,先将前面三层中的气泡赶走,然后再加入第五层海绵。夹紧,不要让夹板扭动。
        4.放入“三明治”时要按照“黑对黑”的原则放入。在倒满转膜液之前不要忘记将一个冰盒放在转膜槽内。将转膜槽放在装满冰的盆里,开始转膜。我们需要的分子量范围是:>250kd~31kd,我们转膜的条件为恒压70v,2h。

        封闭
        1.  封闭液的配制(5%):将10g脱脂奶粉加入到200mlPBS中,在漏斗中过滤。
        2.  将膜取出,放在去离子水中冲洗一下,放入封闭液中。
        3.  放在摇床上封闭2h。

        一抗的孵育
        1.  将膜从封闭液中取出,用PBS冲洗3次,每次10min。按照分子量将膜剪开。
        2.  一抗有两种孵育方法:一、室温孵育:在桌面上铺一张纸,将剪好的膜放在纸上,加上相应的一抗。二、过夜孵育:准备夹链袋,将膜用镊子放入,但是不能碰到膜的表面,将抗体加入,不能有气泡。在室温下摇动1h(可以将枪按到一档)4℃过夜。
        3.  APP(1:200),Navβ2(1:200),Nav1.2(1:200),NR1(1:200),BACE1(1:1000),GAPDH(1:1000)

        二抗的孵育
        1.  将膜从夹链袋中取出,一抗回收放在PBST中冲洗3次,10min一次。
        2.  二抗在暗室中进行,GAPDH二抗用800鼠(1:4000),其他用700兔(1:4000)。
        3.  二抗孵育1h。
        4.  洗膜:PBST冲洗3次,每次10min。最后再用PBS冲洗一次。扫膜。
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