【建议】western blot步骤
丁香园论坛
5579
1.完成western blot实验
步骤：
一、蛋白样品的提取：
1.弃去旧培养基，用PBS清洗2次
2.加入胰酶消化，待细胞消化完成后，加入少量培养基终止消化反应
3.吸取细胞至离心管中，尽可能完全收集，离心，2500rpm，5min
4.弃上清，加1ml PBS清洗，将其移入EP管中，再次离心，2500rpm（13000rpm也可），5min，将残液吸取完全（-80℃冰箱内放置过夜，也可长期保存）
5.向每个EP管中加入适量IP裂解液（蛋白酶抑制剂，依细胞量多少而定),轻掸混匀，置于冰上
6.10min后，超声细胞仪打碎细胞，一般<10次，置于冰上1-2小时
7.4℃离心，13000rpm，5min
8.轻轻吸取上清液，置于新的EP管中,弃沉淀
二、标准曲线及蛋白浓度的测定(BCA法,适用于碧云天,参考说明书)：
1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀
2.将蛋白标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加入96孔板的标准品孔中，并加PBS补足至20μl
3.加适当体积样品到样品孔中，加PBS补足至20μl，另设空白对照组
4.各孔加入200μlBCA工作液，37℃温箱内放置30min
5.在酶标仪中测定波长，得标准曲线
6.根据标准曲线求得各样品浓度
7.取适量样品，各加入1/2体积的2×loading buffer，99℃煮蛋白，5min，待冷却后13000rpm高速离心1min
三、制胶：
1.洗玻片：先用洗洁精洗净，再用无水乙醇冲洗，晾干或用吹风机吹干
2.根据所给配方配制分离胶（下层胶）及浓缩胶（上层胶），TEMED最后加
先下层胶：
10%胶：5ml 10ml 10%胶：5ml 10ml
蒸馏水： 1.7ml 3.3ml 1.3ml 2.7ml
30%Acr-Bis(29:1): 1.3ml 2.7ml 1.7ml 3.3ml
1M Tris,pH8.8 1.9ml 3.8ml 1.9ml 3.8ml
10%SDS 0.05ml 0.1ml 0.05ml 0.1ml
10%过硫酸铵 0.05ml 0.1ml 0.05ml 0.1ml
TEMED 0.003ml 0.006ml 0.002ml 0.004ml
45-60min出现水平线后，再配下层胶，配好胶后，将
上层胶（5%）：
2ml 3ml 4ml 6ml
蒸馏水： 1.4ml 2.1ml 2.7ml 4.1ml
30%Acr-Bis(29:1): 0.33ml 0.5ml 0.67ml 1.0ml
1M Tris,pH6.8 0.25ml 0.38ml 0.5ml 0.75ml
10%SDS 0.02ml 0.03ml 0.04ml 0.06ml
10%过硫酸铵 0.02ml 0.03ml 0.04ml 0.06ml
TEMED 0.002ml 0.003ml 0.004ml 0.006ml
3.装好装置，对齐玻板，保持底部齐平，高面在里，压紧防漏（可用乙醇测试）
4.加入分离胶至绿色板底线附近，再加入1-2ml无水乙醇压平
5.30min-1h可见分层，倒去乙醇，滤纸吸干
6.加入浓缩胶至溢出，插入梳子，注意勿留气泡，放置30min
四、电泳
1.胶凝后，装好装置，玻璃高面在外，装置内加满新鲜电泳液，外部可用回收的
2.两端用力均匀拔掉梳子
3.上样，10-40ug/孔，marker 3ul，注意换枪头，每孔最多30ul
4.电泳，恒压，110V
5.电泳终止标志：待含溴酚蓝的buffer接近玻板底面
五、转膜
1.现用现配转膜液，4℃保存；PVDF膜、滤纸、海绵，在转膜液中浸泡10min（PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min~2min。再用转膜液涮一下。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合）
2.取出胶，将上层胶切去，下层胶底部切掉一点，放入转膜液中浸泡
3.夹‘三明治’：（黑胶白膜，勿反）
【黑面-海绵-3滤纸-胶-PVDF膜-3滤纸-海绵-白面】
注意不要留气泡
4.装好装置（红对红，黑对黑），并将1L转膜液倒入到电泳槽中，恒电流200mA，1.5h，周围置冰防过热
5.转膜结束，在膜上做好标记
六、封闭
1.将膜置入PBST（PBS:TWEEN=1000：1）中摇洗3次，每次10min
2.用5%的脱脂牛奶（1g奶粉加20mlPBST可用于俩张膜）封闭，室温，摇床上2h，或过夜
七、孵育一抗
1将膜在PBST中涮一遍
2.将一抗加入PBST中（一般为1:1000），将膜置于此一抗溶液中，摇床上摇一会，确保膜与一抗充分接触，正面朝下，而后4℃冰箱内过夜或室温1h左右
八、孵育二抗
1.PBST洗三次
2.将二抗加到PBST中（1:10000），室温1h
九、显影
PBST多洗几次，ECL试剂盒中A、B液等体积混匀，滴加在膜正面，再反过来，暗室显影
步骤：
一、蛋白样品的提取：
1.弃去旧培养基，用PBS清洗2次
2.加入胰酶消化，待细胞消化完成后，加入少量培养基终止消化反应
3.吸取细胞至离心管中，尽可能完全收集，离心，2500rpm，5min
4.弃上清，加1ml PBS清洗，将其移入EP管中，再次离心，2500rpm（13000rpm也可），5min，将残液吸取完全（-80℃冰箱内放置过夜，也可长期保存）
5.向每个EP管中加入适量IP裂解液（蛋白酶抑制剂，依细胞量多少而定),轻掸混匀，置于冰上
6.10min后，超声细胞仪打碎细胞，一般<10次，置于冰上1-2小时
7.4℃离心，13000rpm，5min
8.轻轻吸取上清液，置于新的EP管中,弃沉淀
二、标准曲线及蛋白浓度的测定(BCA法,适用于碧云天,参考说明书)：
1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀
2.将蛋白标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加入96孔板的标准品孔中，并加PBS补足至20μl
3.加适当体积样品到样品孔中，加PBS补足至20μl，另设空白对照组
4.各孔加入200μlBCA工作液，37℃温箱内放置30min
5.在酶标仪中测定波长，得标准曲线
6.根据标准曲线求得各样品浓度
7.取适量样品，各加入1/2体积的2×loading buffer，99℃煮蛋白，5min，待冷却后13000rpm高速离心1min
三、制胶：
1.洗玻片：先用洗洁精洗净，再用无水乙醇冲洗，晾干或用吹风机吹干
2.根据所给配方配制分离胶（下层胶）及浓缩胶（上层胶），TEMED最后加
先下层胶：
10%胶：5ml 10ml 10%胶：5ml 10ml
蒸馏水： 1.7ml 3.3ml 1.3ml 2.7ml
30%Acr-Bis(29:1): 1.3ml 2.7ml 1.7ml 3.3ml
1M Tris,pH8.8 1.9ml 3.8ml 1.9ml 3.8ml
10%SDS 0.05ml 0.1ml 0.05ml 0.1ml
10%过硫酸铵 0.05ml 0.1ml 0.05ml 0.1ml
TEMED 0.003ml 0.006ml 0.002ml 0.004ml
45-60min出现水平线后，再配下层胶，配好胶后，将
上层胶（5%）：
2ml 3ml 4ml 6ml
蒸馏水： 1.4ml 2.1ml 2.7ml 4.1ml
30%Acr-Bis(29:1): 0.33ml 0.5ml 0.67ml 1.0ml
1M Tris,pH6.8 0.25ml 0.38ml 0.5ml 0.75ml
10%SDS 0.02ml 0.03ml 0.04ml 0.06ml
10%过硫酸铵 0.02ml 0.03ml 0.04ml 0.06ml
TEMED 0.002ml 0.003ml 0.004ml 0.006ml
3.装好装置，对齐玻板，保持底部齐平，高面在里，压紧防漏（可用乙醇测试）
4.加入分离胶至绿色板底线附近，再加入1-2ml无水乙醇压平
5.30min-1h可见分层，倒去乙醇，滤纸吸干
6.加入浓缩胶至溢出，插入梳子，注意勿留气泡，放置30min
四、电泳
1.胶凝后，装好装置，玻璃高面在外，装置内加满新鲜电泳液，外部可用回收的
2.两端用力均匀拔掉梳子
3.上样，10-40ug/孔，marker 3ul，注意换枪头，每孔最多30ul
4.电泳，恒压，110V
5.电泳终止标志：待含溴酚蓝的buffer接近玻板底面
五、转膜
1.现用现配转膜液，4℃保存；PVDF膜、滤纸、海绵，在转膜液中浸泡10min（PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min~2min。再用转膜液涮一下。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合）
2.取出胶，将上层胶切去，下层胶底部切掉一点，放入转膜液中浸泡
3.夹‘三明治’：（黑胶白膜，勿反）
【黑面-海绵-3滤纸-胶-PVDF膜-3滤纸-海绵-白面】
注意不要留气泡
4.装好装置（红对红，黑对黑），并将1L转膜液倒入到电泳槽中，恒电流200mA，1.5h，周围置冰防过热
5.转膜结束，在膜上做好标记
六、封闭
1.将膜置入PBST（PBS:TWEEN=1000：1）中摇洗3次，每次10min
2.用5%的脱脂牛奶（1g奶粉加20mlPBST可用于俩张膜）封闭，室温，摇床上2h，或过夜
七、孵育一抗
1将膜在PBST中涮一遍
2.将一抗加入PBST中（一般为1:1000），将膜置于此一抗溶液中，摇床上摇一会，确保膜与一抗充分接触，正面朝下，而后4℃冰箱内过夜或室温1h左右
八、孵育二抗
1.PBST洗三次
2.将二抗加到PBST中（1:10000），室温1h
九、显影
PBST多洗几次，ECL试剂盒中A、B液等体积混匀，滴加在膜正面，再反过来，暗室显影
