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        【建议】western blot步骤

        丁香园论坛

        5540
        1.完成western blot实验
        步骤:
        一、蛋白样品的提取:
        1.弃去旧培养基,用PBS清洗2次
        2.加入胰酶消化,待细胞消化完成后,加入少量培养基终止消化反应
        3.吸取细胞至离心管中,尽可能完全收集,离心,2500rpm,5min
        4.弃上清,加1ml PBS清洗,将其移入EP管中,再次离心,2500rpm(13000rpm也可),5min,将残液吸取完全(-80℃冰箱内放置过夜,也可长期保存)
        5.向每个EP管中加入适量IP裂解液(蛋白酶抑制剂,依细胞量多少而定),轻掸混匀,置于冰上
        6.10min后,超声细胞仪打碎细胞,一般<10次,置于冰上1-2小时
        7.4℃离心,13000rpm,5min
        8.轻轻吸取上清液,置于新的EP管中,弃沉淀
        二、标准曲线及蛋白浓度的测定(BCA法,适用于碧云天,参考说明书):
        1.根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积试剂B(50:1)配置适量BCA工作液,充分混匀
        2.将蛋白标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加入96孔板的标准品孔中,并加PBS补足至20μl
        3.加适当体积样品到样品孔中,加PBS补足至20μl,另设空白对照组
        4.各孔加入200μlBCA工作液,37℃温箱内放置30min
        5.在酶标仪中测定波长,得标准曲线
        6.根据标准曲线求得各样品浓度
        7.取适量样品,各加入1/2体积的2×loading buffer,99℃煮蛋白,5min,待冷却后13000rpm高速离心1min
        三、制胶:
        1.洗玻片:先用洗洁精洗净,再用无水乙醇冲洗,晾干或用吹风机吹干
        2.根据所给配方配制分离胶(下层胶)及浓缩胶(上层胶),TEMED最后加
        先下层胶:
        10%胶:5ml 10ml 10%胶:5ml 10ml
        蒸馏水: 1.7ml 3.3ml 1.3ml 2.7ml
        30%Acr-Bis(29:1): 1.3ml 2.7ml 1.7ml 3.3ml
        1M Tris,pH8.8 1.9ml 3.8ml 1.9ml 3.8ml
        10%SDS 0.05ml 0.1ml 0.05ml 0.1ml
        10%过硫酸铵 0.05ml 0.1ml 0.05ml 0.1ml
        TEMED 0.003ml 0.006ml 0.002ml 0.004ml

        45-60min出现水平线后,再配下层胶,配好胶后,将
        上层胶(5%):
        2ml 3ml 4ml 6ml
        蒸馏水: 1.4ml 2.1ml 2.7ml 4.1ml
        30%Acr-Bis(29:1): 0.33ml 0.5ml 0.67ml 1.0ml
        1M Tris,pH6.8 0.25ml 0.38ml 0.5ml 0.75ml
        10%SDS 0.02ml 0.03ml 0.04ml 0.06ml
        10%过硫酸铵 0.02ml 0.03ml 0.04ml 0.06ml
        TEMED 0.002ml 0.003ml 0.004ml 0.006ml

        3.装好装置,对齐玻板,保持底部齐平,高面在里压紧防漏(可用乙醇测试)
        4.加入分离胶至绿色板底线附近,再加入1-2ml无水乙醇压平
        5.30min-1h可见分层,倒去乙醇,滤纸吸干
        6.加入浓缩胶至溢出,插入梳子,注意勿留气泡,放置30min
        四、电泳
        1.胶凝后,装好装置,玻璃高面在外,装置加满新鲜电泳液,外部可用回收的
        2.两端用力均匀拔掉梳子
        3.上样,10-40ug/,marker 3ul,注意换枪头,每孔最多30ul
        4.电泳,恒压,110V
        5.电泳终止标志:待含溴酚蓝的buffer接近玻板底面
        五、转膜
        1.现用现配转膜液,4℃保存;PVDF膜、滤纸、海绵,在转膜液中浸泡10min(PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min~2min。再用转膜液涮一下。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合)
        2.取出胶,将上层胶切去,下层胶底部切掉一点,放入转膜液中浸泡
        3.夹‘三明治’:(黑胶白膜,勿反)
        【黑面-海绵-3滤纸-胶-PVDF膜-3滤纸-海绵-白面】
        注意不要留气泡
        4.装好装置(红对红,黑对黑),并将1L转膜液倒入到电泳槽中,恒电流200mA,1.5h,周围置冰防过热
        5.转膜结束,在膜上做好标记
        六、封闭
        1.将膜置入PBST(PBS:TWEEN=1000:1)中摇洗3次,每次10min
        2.用5%的脱脂牛奶(1g奶粉加20mlPBST可用于俩张膜)封闭,室温,摇床上2h,或过夜
        七、孵育一抗
        1将膜在PBST中涮一遍
        2.将一抗加入PBST中(一般为1:1000),将膜置于此一抗溶液中,摇床上摇一会,确保膜与一抗充分接触,正面朝下,而后4℃冰箱内过夜或室温1h左右
        八、孵育二抗
        1.PBST洗三次
        2.将二抗加到PBST中(1:10000),室温1h
        九、显影
        PBST多洗几次,ECL试剂盒中A、B液等体积混匀,滴加在膜正面,再反过来,暗室显影
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