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        【原创】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 !

        丁香园论坛

        3162
        我上个月做了 mating (酵母双杂交的一种办法)。
        现在已经做到了,X-gal assay。
        从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。
        第二次 挑选出了74个蓝色克隆。
        可是,对比发现重复变蓝的只有 11个。

        What can I do for it NEXT~

        我的具体步骤是。

        一 :文库建立

        1. mammalian cell total RNA --> Poly A RNA --> dsRNA --> 提纯 dsRNA。
        2. 将提纯的dsRNA 转染到AH109细胞株,涂在 150ㅠ待 3~5天克隆出现 并长势饱满.
        3. 每个150ㅠ, 放入5ml freezing media ,将细胞收集在一起,均匀混合,1ml 分装, -70度保存。

        二 :酵母双杂交

        1 . mating , mating product 分别涂在 40个 TDO(SD/-H -L -T), 10个 QDO( SD/-A-H-L-T) 。
        2 . mating efficiency 3% 大于下限值2%。
        3 . 实验步骤说明上,说3-8天克隆会出现。可是我的 大概 12天才长了出来(TDO)。
        小心的将 TDO上长出来的 280个克隆,转移到TDO。
         再次培养了4天左右  发现 21个在转移后没有继续长,所以淘汰掉。
        4.将TDO上的克隆,转移到 QDO (for strong interaction assay )/ 牙签上 剩下的一点点细胞 划在了100ㅠ的TDO(for colony X-a-gal filter assay) 。 双重选择,在QDO上生长,并在X-a-gal筛选中变蓝的克隆。
        5. 以上方法,选出223个在 QDO 上生长的克隆。
        6. X-a-gal filter assay 两次。 

        到这里 问题出来了 从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。
        第二次 挑选出了74个蓝色克隆。
        可是,对比发现重复变蓝的只有 11个。
        而且,书上说 X-a-gal filter assay最多不要超过8小时。
        可是我的克隆,基本都是在6-8小时之间 变蓝的。

        请大家 一起分析一下,怎么两次 X-a-gal filter assay 变蓝的差距这么大。
        难道,都是假阳性??

        我首先将两次实验重合的 11个克隆的 plasmid DNA 提了出来,正在测序。

        剩下的怎么办? 11个也太少了,之后的实验,怎么办? 有必要 再作一次 X-a-gal filter assay么?? 要是,又发生么变化,怎么办??

        拜托各位!! !
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