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        我构建载体的思路,请各位老师指教!

        丁香园论坛

        1850
        以下是我构建载体的思路,但自己心里没底,不知是否可行,请各位老师指教!
        目 的:构建hPOT1正反义基因真核表达载体
        材料 DH5α大肠杆菌由学校细胞生物教研室提供;含全长hPOT1 cDNA的pLPCNMyc POT1质粒由美国Rockefeller大学的de Lange教授惠赠;pcDNA-3.1(-)真核表达载体购自美国Invitrogen公司;限制性内切酶BamHⅠ、Xho Ⅰ、Nhe I、T4DNA连接酶和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)购自美国Promag公司;超纯质粒提取试剂盒、琼脂糖DNA回收试剂盒购自北京博大泰克公司。Lipofect Amine购自美国Invitrogen公司,G418、MTT为Gibco BRL公司。
        方法
        1、将pLPCNMyc POT1质粒转化XL1 blue大肠杆菌,进行扩增,酶切鉴定。该质粒全长7600bp,目的片段hPOT1 cDNA(1905bp)克隆在BamH I和Xho I限制性内切酶位点之间。用BamH I和Xho I酶切后应该只有1905和5695两个片段;
        pLPCNMyc POT1质粒酶切后目的片段如下:
        5' GA TCC TTG GTT CCA GCA……GAA GAT GTA ATC TAA C
        3' G AAC CAA GGT CGT……CTT CTA CAT TAG ATT GAG CT
        2、用胶回收试剂盒回收目的片段;
        3、合成Kozak序列:
        方案1:
        Nhe I
        GCTAGCATGG
        CGATCGTACCCTAG
        方案2:
        Nhe I
        ACGGCTAGCATGG
        TGCCGATCGTACCCTAG
        4、用T4DNA连接酶将目的片段与Kozak序列联接起来;
        5、用Nhe I切割联接后的片段,可与用Nhe I和Xho I酶切的pcDNA-3.1(-)质粒正向联接,为正义表达载体,命名为pcDNA-s-hPOT1;回收的目的片段与用BamH I和Xho I酶切的pcDNA-3.1(-)质粒反向联接,为反义表达载体命名为pcDNA-as-hPOT1;
        6、分别将重组质粒pcDNA-s-hPOT1和pcDNA-as-hPOT1转化DH5α大肠杆菌进行扩增;
        7、分别挑取正反义的阳性克隆进行质粒小抽,pcDNA-s-hPOT1用Nhe I和Xho I酶切,应该出现2004bp和5374bp;pcDNA-as-hPOT1用BamH I和Xho I酶切,应该出现1905bp和5344bp;然后进行T7启动子至BGH间序列测定,以保证构建载体联接的正确性;
        7、将正反义真核表达载体pcDNA-s-hPOT1、pcDNA-as-hPOT1及空载体用Lipofect Amine转染入SGC7901细胞内,用G418筛选。
        疑问:
        1、Kozak序列中所加的Nhe I酶切位点位于第二(或4)位的碱基,能否被Nhe I酶识别?
        2、hPOT1 cDNA的CDS区是:ATG TCT TTG GTT CCA GCA ACA……………
        而改造后的hPOT1 cDNA是 ATG GGA TCC TTG GTT CCA GCA ACG……………
        多了一个GGA编码的苷氨酸,是否会影响其功能?
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