我构建载体的思路，请各位老师指教!
丁香园论坛
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以下是我构建载体的思路，但自己心里没底，不知是否可行，请各位老师指教!
目 的：构建hPOT1正反义基因真核表达载体
材料 DH5α大肠杆菌由学校细胞生物教研室提供；含全长hPOT1 cDNA的pLPCNMyc POT1质粒由美国Rockefeller大学的de Lange教授惠赠；pcDNA-3.1(－)真核表达载体购自美国Invitrogen公司；限制性内切酶BamHⅠ、Xho Ⅰ、Nhe I、T4DNA连接酶和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）购自美国Promag公司；超纯质粒提取试剂盒、琼脂糖DNA回收试剂盒购自北京博大泰克公司。Lipofect Amine购自美国Invitrogen公司，G418、MTT为Gibco BRL公司。
方法
1、将pLPCNMyc POT1质粒转化XL1 blue大肠杆菌，进行扩增，酶切鉴定。该质粒全长7600bp，目的片段hPOT1 cDNA(1905bp)克隆在BamH I和Xho I限制性内切酶位点之间。用BamH I和Xho I酶切后应该只有1905和5695两个片段；
pLPCNMyc POT1质粒酶切后目的片段如下：
5＇ GA TCC TTG GTT CCA GCA……GAA GAT GTA ATC TAA C
3＇ G AAC CAA GGT CGT……CTT CTA CAT TAG ATT GAG CT
2、用胶回收试剂盒回收目的片段；
3、合成Kozak序列：
方案1：
Nhe I
GCTAGCATGG
CGATCGTACCCTAG
方案2：
Nhe I
ACGGCTAGCATGG
TGCCGATCGTACCCTAG
4、用T4DNA连接酶将目的片段与Kozak序列联接起来；
5、用Nhe I切割联接后的片段，可与用Nhe I和Xho I酶切的pcDNA-3.1(－)质粒正向联接，为正义表达载体，命名为pcDNA-s-hPOT1；回收的目的片段与用BamH I和Xho I酶切的pcDNA-3.1(－)质粒反向联接，为反义表达载体命名为pcDNA-as-hPOT1；
6、分别将重组质粒pcDNA-s-hPOT1和pcDNA-as-hPOT1转化DH5α大肠杆菌进行扩增；
7、分别挑取正反义的阳性克隆进行质粒小抽，pcDNA-s-hPOT1用Nhe I和Xho I酶切，应该出现2004bp和5374bp；pcDNA-as-hPOT1用BamH I和Xho I酶切，应该出现1905bp和5344bp；然后进行T7启动子至BGH间序列测定，以保证构建载体联接的正确性；
7、将正反义真核表达载体pcDNA-s-hPOT1、pcDNA-as-hPOT1及空载体用Lipofect Amine转染入SGC7901细胞内，用G418筛选。
疑问：
1、Kozak序列中所加的Nhe I酶切位点位于第二(或4)位的碱基，能否被Nhe I酶识别？
2、hPOT1 cDNA的CDS区是：ATG TCT TTG GTT CCA GCA ACA……………
而改造后的hPOT1 cDNA是 ATG GGA TCC TTG GTT CCA GCA ACG……………
多了一个GGA编码的苷氨酸，是否会影响其功能？
目 的：构建hPOT1正反义基因真核表达载体
材料 DH5α大肠杆菌由学校细胞生物教研室提供；含全长hPOT1 cDNA的pLPCNMyc POT1质粒由美国Rockefeller大学的de Lange教授惠赠；pcDNA-3.1(－)真核表达载体购自美国Invitrogen公司；限制性内切酶BamHⅠ、Xho Ⅰ、Nhe I、T4DNA连接酶和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）购自美国Promag公司；超纯质粒提取试剂盒、琼脂糖DNA回收试剂盒购自北京博大泰克公司。Lipofect Amine购自美国Invitrogen公司，G418、MTT为Gibco BRL公司。
方法
1、将pLPCNMyc POT1质粒转化XL1 blue大肠杆菌，进行扩增，酶切鉴定。该质粒全长7600bp，目的片段hPOT1 cDNA(1905bp)克隆在BamH I和Xho I限制性内切酶位点之间。用BamH I和Xho I酶切后应该只有1905和5695两个片段；
pLPCNMyc POT1质粒酶切后目的片段如下：
5＇ GA TCC TTG GTT CCA GCA……GAA GAT GTA ATC TAA C
3＇ G AAC CAA GGT CGT……CTT CTA CAT TAG ATT GAG CT
2、用胶回收试剂盒回收目的片段；
3、合成Kozak序列：
方案1：
Nhe I
GCTAGCATGG
CGATCGTACCCTAG
方案2：
Nhe I
ACGGCTAGCATGG
TGCCGATCGTACCCTAG
4、用T4DNA连接酶将目的片段与Kozak序列联接起来；
5、用Nhe I切割联接后的片段，可与用Nhe I和Xho I酶切的pcDNA-3.1(－)质粒正向联接，为正义表达载体，命名为pcDNA-s-hPOT1；回收的目的片段与用BamH I和Xho I酶切的pcDNA-3.1(－)质粒反向联接，为反义表达载体命名为pcDNA-as-hPOT1；
6、分别将重组质粒pcDNA-s-hPOT1和pcDNA-as-hPOT1转化DH5α大肠杆菌进行扩增；
7、分别挑取正反义的阳性克隆进行质粒小抽，pcDNA-s-hPOT1用Nhe I和Xho I酶切，应该出现2004bp和5374bp；pcDNA-as-hPOT1用BamH I和Xho I酶切，应该出现1905bp和5344bp；然后进行T7启动子至BGH间序列测定，以保证构建载体联接的正确性；
7、将正反义真核表达载体pcDNA-s-hPOT1、pcDNA-as-hPOT1及空载体用Lipofect Amine转染入SGC7901细胞内，用G418筛选。
疑问：
1、Kozak序列中所加的Nhe I酶切位点位于第二(或4)位的碱基，能否被Nhe I酶识别？
2、hPOT1 cDNA的CDS区是：ATG TCT TTG GTT CCA GCA ACA……………
而改造后的hPOT1 cDNA是 ATG GGA TCC TTG GTT CCA GCA ACG……………
多了一个GGA编码的苷氨酸，是否会影响其功能？
