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        包涵体提出、纯化、复性必胜技

        丁香园论坛

        2574
        下列方法已在本实验室验证,复性任何包涵体,必定能得到目的蛋白:

        菌体为超声法裂解,裂解溶液中含
        50mM Tris-HCl, pH 8.0,
        100mM NaCl,
        5mM EDTA,
        0.1% NaN3,
        0.5% Triton-X100,
        在使用前加入 0.1mM PMSF

        每250毫升裂解液中加入约50克菌体,工作15s,间隔15秒,超声破碎45分钟,超声后加入10mM MgSO4 和0.1mg/ml 的溶菌酶和Dnase 0.01mg/ml,室温放置20分钟,6000RPM离心15分钟,保留沉淀。

        再次加入裂解液,超声破细胞后,加溶菌酶和Dnase, 上述过程重复三次。

        用下述的溶液将包涵体悬浮,离心收集包涵体。
        50mM Tris-HCl, pH 8.0
        100mM NaCl
        5mM EDTA
        0.1% NaN3

        用下述溶液悬浮包涵体,离心收集包涵体。
        50mM Tris-HCl, pH 8.0
        100mM NaCl
        5mM EDTA
        0.1% NaN3
        1M 尿素
        如暂时不用,放入-20℃保存。

        包涵体的溶解
        将包涵体悬浮在下述溶液中,4℃振荡过夜。
        100mM Tris
        50mM Glycine
        8.5M 尿素
        溶液用HCl调节到pH 8.0后加入
        25mM DTT

        6000RPM离心,取上清,去除不溶解物。

        包涵体蛋白的复性

        将溶解的包涵体装入透析袋,在4℃下将透析袋浸入下列溶液依次透析:
        0.1M Tris
        0.4M L-Arginine
        1 mM EDTA
        0.2mM PMSF
        4M 尿素 溶液pH调节到8.0
        透析24小时

        0.1M Tris
        0.4M L-Arginine
        1 mM EDTA
        0.2mM PMSF
        2M 尿素 溶液pH调节到8.0
        透析24小时

        0.1M Tris
        0.4M L-Arginine
        1 mM EDTA
        0.2mM PMSF
        1M 尿素 溶液pH调节到8.0
        透析24小时

        0.1M Tris
        0.4M L-Arginine
        1 mM EDTA
        0.2mM PMSF
        0 M 尿素 溶液pH调节到8.0
        透析24小时

        0.025M Tris
        0.1M L-Arginine
        0.25 mM EDTA
        0.2mM PMSF
        0 M 尿素 溶液pH调节到8.0
        透析24小时

        10mM Tris-HCl pH8.0
        150mM NaCl,
        1mM EDTA
        0.02% NaN3.
        透析24小时

        透析时注意透析袋的截留分子量

        下面的工作就简单了,因为复性的蛋白已经在生理缓冲液中,进行阴阳离子交换层析爱怎么整就怎么整它了。
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