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        用 T4 DNA连接酶连接RNA分子

        相关实验: T4 DNA 连接酶连接 RNA 分子

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一材料与设备

        1)T4DNA 连接酶

        2)T4 多聚核酸激酶

        3)RNA 供体

        4) 受体

        5) 寡核苷酸 cDNA 模板

        6)10X 连接缓冲液:500 mmol/LTris-HCl(pH7.5),100 mmol/LMgCl2,200 mmol/LDTT,0.5 mg/mLBSA(适用 NewEngtandBiolabs 连接酶)或 660 mmol/LTris-HCl(pH7.6),66 mmol/LMgCl2,lOOmmol/LDTT(适用于 Amersham/USB 连接酶)

                                            用 T4 DNA连接酶连接RNA分子


        7)[Y32P]ATP(10mCi/ml,300Ci/mmol=3.33umol/L)

        8) 无 RNase 水

        9)l0 mmol/LATP

        10)RNasin。

        11) 无 RNase 的 DNase。

        12) 真空离心浓缩仪。

        13)5XTBE:54 gTris,27.5 g 硼酸,20 ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

        14)2X 变性胶上样缓冲液:10mol/L 尿素,1XTBE 或 80% 甲醛,1XTBE

        15)TE;10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),lmmol/LEDTA


        二、操作方法

        1. 磷酸化 3'RNA

        1) 在 1.5 ml 管中加入 5ul[γ32P]ATP(50ulCi,16pmol),用真空离心浓缩仪干燥。

        2) 在此管中加入:0.5ul10X 连接缓冲液,3ul20umol/L3'RNA,1ul 水,0.5ulT4 多核苷酸激酶, 终体积为 5.0ul

        3) 于 37℃: 孵育 30〜60 min

        4) 于 75°C 孵育 l0min 或 92〜95℃ 孵育 2 min, 灭活多核苷酸激酶。置于冰上

        2. 连接反应

        1) 在灭活的多核苷酸激酶反应管中,加 1.0ul10×连接缓冲液.3.0ul20umol/L5'RNA,3ul20umol/LcDXA 模板。

        2) 加热至 75℃ 2 min 再室温放置 5 min, 杂交 RNA 与 DNA。

        3) 在杂交反应液中加入 1.l0 mmol/L 冷 ATP,2ul T4DNA 连接酶,至终体积 15ul

        4) 于 30°C 孵育 2〜4 h。

        5) 加 lul 无 RNase 的 DNase, 于 37℃ 孵育 15〜30 min

        6) 加 16ul 2X 上样缓冲液,上样电泳,可以检测到标记的 5'RNA 与 3'RNA 以及相成于连接产物的全长分子。

        注意事项

        对于有效的连接,桥梁 cDNA 模板的浓度非常重要,最好等于或介于两种待连接的 RNA 分子的浓度之间,如模板过量,RNA 分子就会与不同的 cDNA 模板结合,而无法同另意 RNA 分子结合。我们建议连接反应中 RNA 的浓度最好为 0.1〜10umol/L

        来源:丁香实验

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