脂质体2000/Lip2000/转染试剂2000

Lip2000是一种新开发的专有试剂，用于将核酸转染到真核细胞中。
Lip2000具有以下优点：
在许多细胞类型和格式中具有最高的转染效率。
DNA-Lip2000复合物可以直接添加到培养基中的细胞中（有或没有血清）。
转染后不需要去除DNA-Lip2000复合物或更换培养基。
4-6小时后，可以通过更换刷新介质（可选）去除复合物

内容和储存
Lip2000以液体形式供应，浓度为1mg/ml。在4℃下储存。不要冻结。
产品资质
Lip2000已通过用EGFP报告基因转染HEK293细胞进行了广泛测试，该报告基因含有
质粒。Lip2000无微生物污染。

重要指南
执行转染时请遵循以下指南：
1.对于大多数细胞系，制备复合物时使用的DNA（μg）:Lip2000（μl）的比例应为1:2至1:3。使用0.8-1μg DNA和2-3μl Lip2000以24孔格式转染0.5-2×105细胞。通过改变DNA/Lip2000比率来优化转染是可能的。

2.在高细胞密度下，CRITICAL能够转染细胞。建议转染时间为90-95%融合，以获得高效率和表达水平，并尽量减少与高转染活性相关的细胞生长减少。较低的细胞密度适合优化条件。注意在两次实验之间保持标准的接种方案，因为转染效率取决于培养融合。
3.转染过程中不要在培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。
为了获得更好的结果，您可以选择：
在与DNA络合之前，使用Opti-MEM I培养基稀释eLip2000。其他不含血清的培养基（如DMEM）可用于稀释Lip2000，但转染效率可能会受到影响。
注：一些无血清配方可以抑制Lip2000介导的转染，例如：CD 293、293 SFM II和VP-SFM等。

24井格式的转换程序
对于贴壁细胞：转染前一天，将细胞置于生长培养基（不含抗生素）中，使其在转染时达到90-95%融合（24孔板为0.5-2×105个细胞/孔）。
对于悬浮细胞：在制备复合物之前的转染当天，将4-8×105个细胞/500μl生长培养基（不含抗生素）置于24孔板中。
1.对于每个转染样品，制备DNA-Lip2000复合物如下：
•在50μl不含血清的Opti-MEM I还原血清培养基（或其他不含血清培养基）中稀释DNA。轻轻搅拌。
•使用前轻轻混合Lip2000，然后在50μlofOpti MEMI培养基（或其他不含血清的培养基）中稀释适量。轻轻混合，在室温下孵育5分钟。

注意：在30分钟内将稀释的Lip2000与稀释的DNA混合。较长的孵化时间可能会降低活性。若DMEM用作Lip2000的稀释剂，请在5分钟内混合稀释的DNA。孵育5分钟后，将稀释的DNA与稀释的Lip2000（总体积为100μl）混合。
•轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以形成DNALip2000复合物。溶液可能看起来很浑浊，但这不会抑制转染。
注：DNA-Lip2000复合物在室温下稳定至少5小时。
2.向每个孔中加入100μl DNA-Lip2000复合物。来回摇动盘子，轻轻搅拌。
3.将细胞在37℃的CO2培养箱中孵育24-48小时，直到它们准备好进行转基因表达检测。无需去除复合物或更换培养基；然而，4-6小时后可以更换生长培养基，而不会损失转染活性。

对于稳定的细胞系：转染后24小时，将细胞以1:10或更高的稀释度放入新鲜的生长培养基中。第二天添加选择性培养基。
对于悬浮细胞：在向细胞中加入DNA-Lip2000复合物4小时后加入PMA和/或PHA（如果需要）。
提示：对于Jurkat细胞，分别以1μg/ml和50 ng/ml的终浓度添加PHA-L和PMA，可以增强CMV启动子活性和基因表达。对于K562细胞，单独添加PMA足以增强启动子活性。

扩大或减少输血
为了以不同的组织培养形式转染细胞，根据表面积的差异按比例改变Lip2000、DNA、细胞和培养基的用量（见下表）。对于自动化、高通量系统，建议在96孔板中转染更大的络合体积。注意：您可以通过将细胞悬浮液直接添加到板中制备的复合物中，进行快速96孔板转染（板细胞和同时转染）。制备复合物，并以两倍的细胞密度添加细胞

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