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        【交流】大家来看看我的ISH protocol!哪里有问题么?

        丁香园论坛

        2527
        <center> <strong><font>microRNA </font><font>原位杂交 protocol</font></strong></center>


        这个我是以exiqon的protocol为蓝本翻译过来的,有些小步骤上有修改。
        1
        脱蜡水合 RT

        二甲苯undefined3min----二甲苯2x3min——无水乙醇undefined3min——无水乙醇undefined3min——96%乙醇浸入5min——70%乙醇5min——PBS 2-5min

        2蛋白酶k 2ug/ml(临用前配置) 200ul 10min 37度

        40ug/ml 蛋白酶k 1:20稀释于蛋白酶k buffer

        3含0.2%甘氨酸PBS * 2 5min RT(暂时省略该步骤)

        4 PBS *2 5min RT



        5预杂交液 300 ul 10min RT(ISH buffer 我是按照预杂交液和杂交液共同组方配置的,预杂交液加入无酶水,杂交液加入葡聚糖和探针)

        160ul ISH buffer

        40ul 无RNA酶水

        6探针杂交液杂交(临用前配置。65度预热30min线性化探针) 150 ul 3hour 50度

        120ul ISH buffer

        30ul 50%硫酸葡聚糖

        探针1:1000-1:3000 约5-20nM

        盖parafilm,置于湿盒中



        7 SSC中洗 RT

        undefined SSC 5 min

        undefinedSSC 5 min

        0.undefinedSSC 5 min



        8 10%热失活GS in pbs(含0.1%Tween20) 15min RT



        9滴加anti-DIG-AP(Tris缓冲液 1+2%BSA+0.15%Triton)1:800稀释 2h 37度



        10显色:NBT4.5ul+BCIP3.5ul+Levamisole 0.24mg/ml Tris 缓冲液2

        避光显色(显微镜下检测凋亡细胞核呈蓝紫色反应)

        11将玻片置于Tris缓冲液3中10-30min以终止反应

        12水溶性封片剂(9ml甘油+1ml 0.01M TBS pH7.2)封片,显微镜下观察拍片统计结果。

        <center> <font>相关液体配方</font></center>

        蛋白酶k buffer(1ml) 5ul 1M Tris-HCL

        2ul 5M EDTA

        0.2ul 5M NaCL

        900ul 无酶水 定容至1000ul 灭菌

        ISH buffer(8ml):  

        50% 去离子甲酰胺 …… 100%去离子甲酰胺 5ml

        0.3M氯化钠 ……5M氯化钠 600ul

        20mM Tris HCL , pH 8.0 ……1M Tris HCL,pH8.0 200ul

        5 mM EDTA ……0.5MEDTA 10ul

        10mM l磷酸钠 ph 8.0 ……Na2HPO4NaH2PO4 ph8.0 500ul

        0.5mg/ml 酵母RNA ……50mg/ml 酵母tRNA 100ul

        无RNA酶水 1.6ml

        -80度保存

        预杂交液(200ul)临用前配置

        ISH buffer 160ul

        无RNA酶水 40ul

        杂交液(150ul)临用前配置

        ISH buffer 120ul

        10%硫酸葡聚糖 ……50%硫酸葡聚糖 30ul

        20nM探针(1:1000-1:3000)

        湿盒中:50% 甲酰胺

        1xSSC

        母液(未用无酶水配置的需加0.1%DEPC后灭菌):

        1.1M Tris-HCL pH8.0(100ML): 12.11gTris溶于80ml重蒸水中,并加浓盐酸4.2ml.pH8.0,定容至100ml

        2.5M EDTA(10ml):1.861gEDTA加入8mlDDW,加热至60度,加入0.2gNaOH,完全溶解冷却至室温。调pH调至8.0,加重蒸水至10ml,灭菌室温保存。



        3.5MNaCl100ml):取29.22gNaCl80ml重蒸水中,加重蒸水至100ml。高压灭菌后室温保存。



        4.0.2M Na2HPO4NaH2PO4 ph8.050ml):Na2HPO4·12H2O 3.384g+ NaH2PO4·2H2O0.083g溶于DDW,调ph8.0,定容至50ml,灭菌。



        5.50%硫酸葡聚糖(1ml):1g硫酸葡聚糖于2mlRNA酶水中。 65度水浴中融化硫酸葡聚糖。



        6.2undefinedSSC100ml):NaCL 17.53g+柠檬酸钠8.82g+DDW 80ml,用5N HCL调至pH7.0,定容至100ml,灭菌。



        7.undefinedPBS500ml):PBS1 in 500ml DDW ,加depc 0.5ml 灭菌。



        8.RNA酶水(500ml):0.5mlDEPC加入500ml DDW,剧烈摇匀后静置数小时,灭菌。



        9.50mg/ml酵母tRNA25mg酵母tRNA冻干粉用0.5ml 无酶无菌水稀释,放置一小时后分装。
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