【交流】大家来看看我的ISH protocol！哪里有问题么？
丁香园论坛
2543
<center>
<strong><font>microRNA </font><font>原位杂交 protocol</font></strong></center>
这个我是以exiqon的protocol为蓝本翻译过来的，有些小步骤上有修改。
1脱蜡水合 RT
二甲苯undefined3min----二甲苯2x3min——无水乙醇undefined3min——无水乙醇undefined3min——96%乙醇浸入5min——70%乙醇5min——PBS 2-5min
2蛋白酶k 2ug/ml(临用前配置) 200ul 10min 37度
40ug/ml 蛋白酶k 1:20稀释于蛋白酶k buffer
3含0.2%甘氨酸PBS * 2 5min RT（暂时省略该步骤）
4 PBS *2 5min RT
5预杂交液 300 ul 10min RT（ISH buffer 我是按照预杂交液和杂交液共同组方配置的，预杂交液加入无酶水，杂交液加入葡聚糖和探针）
160ul ISH buffer
40ul 无RNA酶水
6探针杂交液杂交(临用前配置。65度预热30min线性化探针) 150 ul 3hour 50度
120ul ISH buffer
30ul 50%硫酸葡聚糖
探针1:1000-1:3000 约5-20nM
盖parafilm，置于湿盒中
7 SSC中洗 RT
undefined SSC 5 min
undefinedSSC 5 min
0.undefinedSSC 5 min
8 10%热失活GS in pbs（含0.1%Tween20） 15min RT
9滴加anti-DIG-AP(Tris缓冲液 1+2%BSA+0.15%Triton)1:800稀释 2h 37度
10显色:NBT4.5ul+BCIP3.5ul+Levamisole 0.24mg/ml Tris 缓冲液2
避光显色（显微镜下检测凋亡细胞核呈蓝紫色反应）
11将玻片置于Tris缓冲液3中10-30min以终止反应
12水溶性封片剂（9ml甘油+1ml 0.01M ＴＢＳ ｐＨ７．２）封片，显微镜下观察拍片统计结果。
<center> <font>相关液体配方</font></center>
蛋白酶k buffer（1ml） 5ul 1M Tris-HCL
2ul 5M EDTA
0.2ul 5M NaCL
900ul 无酶水 定容至1000ul 灭菌
ISH buffer（8ml)：
50% 去离子甲酰胺 …… 100%去离子甲酰胺 5ml
0.3M氯化钠 ……5M氯化钠 600ul
20mM Tris HCL , pH 8.0 ……1M Tris HCL,pH8.0 200ul
5 mM EDTA ……0.5MEDTA 10ul
10mM l磷酸钠 ph 8.0 ……Na2HPO4－NaH2PO4 液ph8.0 500ul
0.5mg/ml 酵母RNA ……50mg/ml 酵母tRNA 100ul
无RNA酶水 1.6ml
-80度保存
预杂交液（200ul）临用前配置
ISH buffer 160ul
无RNA酶水 40ul
杂交液（150ul）临用前配置
ISH buffer 120ul
10%硫酸葡聚糖 ……50%硫酸葡聚糖 30ul
20nM探针（1:1000-1:3000）
湿盒中：50% 甲酰胺
1xSSC
母液（未用无酶水配置的需加0.1%DEPC后灭菌）：
1.1M Tris-HCL pH8.0(100ML): 将12.11gTris溶于80ml重蒸水中,并加浓盐酸4.2ml.调pH至8.0，定容至100ml。
2.5M EDTA（10ml）：1.861gEDTA加入8mlDDW，加热至60度，加入0.2gNaOH，完全溶解冷却至室温。调pH调至8.0，加重蒸水至10ml，灭菌室温保存。
3.5MNaCl（100ml）：取29.22gNaCl于80ml重蒸水中，加重蒸水至100ml。高压灭菌后室温保存。
4.0.2M Na2HPO4－NaH2PO4 液ph8.0（50ml）：Na2HPO4·12H2O 3.384g+ NaH2PO4·2H2O0.083g溶于DDW，调ph至8.0，定容至50ml，灭菌。
5.50%硫酸葡聚糖（1ml）：1g硫酸葡聚糖于2ml无RNA酶水中。 65度水浴中融化硫酸葡聚糖。
6.2undefinedSSC（100ml）：NaCL 17.53g+柠檬酸钠8.82g+DDW 80ml，用5N HCL调至pH7.0，定容至100ml，灭菌。
7.undefinedPBS（500ml）：PBS粉1包 in 500ml DDW ，加depc 0.5ml ，灭菌。
8.无RNA酶水（500ml）：0.5mlDEPC加入500ml DDW，剧烈摇匀后静置数小时，灭菌。
9.50mg/ml酵母tRNA：25mg酵母tRNA冻干粉用0.5ml 无酶无菌水稀释，放置一小时后分装。
这个我是以exiqon的protocol为蓝本翻译过来的，有些小步骤上有修改。
1脱蜡水合 RT
二甲苯undefined3min----二甲苯2x3min——无水乙醇undefined3min——无水乙醇undefined3min——96%乙醇浸入5min——70%乙醇5min——PBS 2-5min
2蛋白酶k 2ug/ml(临用前配置) 200ul 10min 37度
40ug/ml 蛋白酶k 1:20稀释于蛋白酶k buffer
3含0.2%甘氨酸PBS * 2 5min RT（暂时省略该步骤）
4 PBS *2 5min RT
5预杂交液 300 ul 10min RT（ISH buffer 我是按照预杂交液和杂交液共同组方配置的，预杂交液加入无酶水，杂交液加入葡聚糖和探针）
160ul ISH buffer
40ul 无RNA酶水
6探针杂交液杂交(临用前配置。65度预热30min线性化探针) 150 ul 3hour 50度
120ul ISH buffer
30ul 50%硫酸葡聚糖
探针1:1000-1:3000 约5-20nM
盖parafilm，置于湿盒中
7 SSC中洗 RT
undefined SSC 5 min
undefinedSSC 5 min
0.undefinedSSC 5 min
8 10%热失活GS in pbs（含0.1%Tween20） 15min RT
9滴加anti-DIG-AP(Tris缓冲液 1+2%BSA+0.15%Triton)1:800稀释 2h 37度
10显色:NBT4.5ul+BCIP3.5ul+Levamisole 0.24mg/ml Tris 缓冲液2
避光显色（显微镜下检测凋亡细胞核呈蓝紫色反应）
11将玻片置于Tris缓冲液3中10-30min以终止反应
12水溶性封片剂（9ml甘油+1ml 0.01M ＴＢＳ ｐＨ７．２）封片，显微镜下观察拍片统计结果。
<center> <font>相关液体配方</font></center>
蛋白酶k buffer（1ml） 5ul 1M Tris-HCL
2ul 5M EDTA
0.2ul 5M NaCL
900ul 无酶水 定容至1000ul 灭菌
ISH buffer（8ml)：
50% 去离子甲酰胺 …… 100%去离子甲酰胺 5ml
0.3M氯化钠 ……5M氯化钠 600ul
20mM Tris HCL , pH 8.0 ……1M Tris HCL,pH8.0 200ul
5 mM EDTA ……0.5MEDTA 10ul
10mM l磷酸钠 ph 8.0 ……Na2HPO4－NaH2PO4 液ph8.0 500ul
0.5mg/ml 酵母RNA ……50mg/ml 酵母tRNA 100ul
无RNA酶水 1.6ml
-80度保存
预杂交液（200ul）临用前配置
ISH buffer 160ul
无RNA酶水 40ul
杂交液（150ul）临用前配置
ISH buffer 120ul
10%硫酸葡聚糖 ……50%硫酸葡聚糖 30ul
20nM探针（1:1000-1:3000）
湿盒中：50% 甲酰胺
1xSSC
母液（未用无酶水配置的需加0.1%DEPC后灭菌）：
1.1M Tris-HCL pH8.0(100ML): 将12.11gTris溶于80ml重蒸水中,并加浓盐酸4.2ml.调pH至8.0，定容至100ml。
2.5M EDTA（10ml）：1.861gEDTA加入8mlDDW，加热至60度，加入0.2gNaOH，完全溶解冷却至室温。调pH调至8.0，加重蒸水至10ml，灭菌室温保存。
3.5MNaCl（100ml）：取29.22gNaCl于80ml重蒸水中，加重蒸水至100ml。高压灭菌后室温保存。
4.0.2M Na2HPO4－NaH2PO4 液ph8.0（50ml）：Na2HPO4·12H2O 3.384g+ NaH2PO4·2H2O0.083g溶于DDW，调ph至8.0，定容至50ml，灭菌。
5.50%硫酸葡聚糖（1ml）：1g硫酸葡聚糖于2ml无RNA酶水中。 65度水浴中融化硫酸葡聚糖。
6.2undefinedSSC（100ml）：NaCL 17.53g+柠檬酸钠8.82g+DDW 80ml，用5N HCL调至pH7.0，定容至100ml，灭菌。
7.undefinedPBS（500ml）：PBS粉1包 in 500ml DDW ，加depc 0.5ml ，灭菌。
8.无RNA酶水（500ml）：0.5mlDEPC加入500ml DDW，剧烈摇匀后静置数小时，灭菌。
9.50mg/ml酵母tRNA：25mg酵母tRNA冻干粉用0.5ml 无酶无菌水稀释，放置一小时后分装。
