【求助】检测细胞周期的流式细胞技术步骤
丁香园论坛
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求详细关于检测细胞周期的流式细胞技术步骤 谢谢各位
期待中！
Procedures of DNA Flow Cytometry (Cell Cycle Analysis)
? Cell pellet (2-5X105 cells/sample)
? Resuspend and fix cells in cold citrate buffer for 5-10 min at 4℃to make the cell density 2X105 cells/200 ml citrate buffer. (May keep cells at 4℃for up to 3-5 days)
? Prewarm solutions A and B at room temperature.
? Transfer cells to a Falcon tube (Becton Dickinson FCM tube, #2052 or #2054).
? Add 450 ml Soln A for 10 min at room temp. vigorous vortexing.
? Add 375 ml Soln B for 10 min at room temp. vigorous vortexing.
? Add 100 ml cold Soln C to stain the nuclei. Brief vortexing.
? Run FAScan
The method is according to Vindelov, et al. (Cytometry 1983; 3:323-7) with some modifications.
? Cell pellet (2-5X105 cells/sample)
? Resuspend and fix cells in cold citrate buffer for 5-10 min at 4℃to make the cell density 2X105 cells/200 ml citrate buffer. (May keep cells at 4℃for up to 3-5 days)
? Prewarm solutions A and B at room temperature.
? Transfer cells to a Falcon tube (Becton Dickinson FCM tube, #2052 or #2054).
? Add 450 ml Soln A for 10 min at room temp. vigorous vortexing.
? Add 375 ml Soln B for 10 min at room temp. vigorous vortexing.
? Add 100 ml cold Soln C to stain the nuclei. Brief vortexing.
? Run FAScan
The method is according to Vindelov, et al. (Cytometry 1983; 3:323-7) with some modifications.
注意：所有操作在冰上进行。
1.收集细胞到15ml的管中，离心。再用10-12mL PBS洗细胞
2.沉淀细胞并重悬。
3.用5mL PBS洗细胞，重复步骤2。
4.在1mL 固定溶液里彻底重悬细胞。（1×PBS；0.5% Paraformaldehyde多聚甲醛,溶液在-70℃冻存，只能冻溶一次。该步骤用于GFP样品））
5.孵育不超过60 min。
6.离心
7.用10-12mL PBS洗细胞，再用5ml洗细胞，离心
8.加300ul含8%的小牛血清重悬打匀
9.加5ml70%乙醇，逐滴加入，放-20度下午测
在FCM分析细胞周期的方法是:收集细胞,PBS洗涤,70%冰乙醇固定,加入PCB溶液室温低渗处理后,离心去上清,加入RNaseA消化后,加入PI.上流式检测.
pc缓冲液是0.2 mol Na2HPO,192 ml, 0.1mol柠檬酸8ml 0.2 M ph=7.8，用作DNA抽提缓冲液，主要是使小的DNA片断出细胞。这样会更利于检测调亡峰。
，过夜！－20度！几个月没问题，超过半年没试过！
2，就是PC buffer！不能代替！抽提和破膜是两个概念！抽提时间30min，有的书上要冰浴，有的不要，
1.收集细胞到15ml的管中，离心。再用10-12mL PBS洗细胞
2.沉淀细胞并重悬。
3.用5mL PBS洗细胞，重复步骤2。
4.在1mL 固定溶液里彻底重悬细胞。（1×PBS；0.5% Paraformaldehyde多聚甲醛,溶液在-70℃冻存，只能冻溶一次。该步骤用于GFP样品））
5.孵育不超过60 min。
6.离心
7.用10-12mL PBS洗细胞，再用5ml洗细胞，离心
8.加300ul含8%的小牛血清重悬打匀
9.加5ml70%乙醇，逐滴加入，放-20度下午测
在FCM分析细胞周期的方法是:收集细胞,PBS洗涤,70%冰乙醇固定,加入PCB溶液室温低渗处理后,离心去上清,加入RNaseA消化后,加入PI.上流式检测.
pc缓冲液是0.2 mol Na2HPO,192 ml, 0.1mol柠檬酸8ml 0.2 M ph=7.8，用作DNA抽提缓冲液，主要是使小的DNA片断出细胞。这样会更利于检测调亡峰。
，过夜！－20度！几个月没问题，超过半年没试过！
2，就是PC buffer！不能代替！抽提和破膜是两个概念！抽提时间30min，有的书上要冰浴，有的不要，
版主好！如果说M期的某种细胞所占比例可以通过流式细胞检测出来吧？如果可以那么如果M期细胞所占比例大，能否说明该细胞的活性大或者说该细胞被激活了？
我的步骤：
1）应用冰冷的1×PBS洗涤收集的细胞3次，离心沉淀细胞，弃上清。
2）以0.5 ml 1×PBS重悬细胞，迅速打入3.5 ml 70％预冷的乙醇中，吹打均匀，4℃储存过夜（一个月之内检测均有效）。
3）离心乙醇固定过的细胞，弃上清，1×PBS洗涤细胞3次以去除残留的乙醇。
4）应用含有0.2 mg RNase A的1 ml PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重悬细胞，37℃染色15 min。
5）应用流式细胞仪测定细胞周期。
1）应用冰冷的1×PBS洗涤收集的细胞3次，离心沉淀细胞，弃上清。
2）以0.5 ml 1×PBS重悬细胞，迅速打入3.5 ml 70％预冷的乙醇中，吹打均匀，4℃储存过夜（一个月之内检测均有效）。
3）离心乙醇固定过的细胞，弃上清，1×PBS洗涤细胞3次以去除残留的乙醇。
4）应用含有0.2 mg RNase A的1 ml PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重悬细胞，37℃染色15 min。
5）应用流式细胞仪测定细胞周期。
zxhuang209 wrote:
版主好！如果说M期的某种细胞所占比例可以通过流式细胞检测出来吧？如果可以那么如果M期细胞所占比例大，能否说明该细胞的活性大或者说该细胞被激活了？
M期细胞比例增大可能说明细胞在有丝分裂过程存在阻碍，也可能是由于S期减少，细胞增殖速率下降，总之，还要具体看情况而定！
那检测哪一期的细胞能否说明细胞活性？流式细胞能否检测细胞活性？
版主 我想能否通过流式细胞术检测某细胞的活性？还是说要用其他方法？谢谢！
2）以0.5 ml 1×PBS重悬细胞，迅速打入3.5 ml 70％预冷的乙醇中，吹打均匀，4℃储存过夜（一个月之内检测均有效）。
如果一个月检测都可以 那么我能否将细胞都存在4度冰箱中，最后统一送去检测？
如果一个月检测都可以 那么我能否将细胞都存在4度冰箱中，最后统一送去检测？
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