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        【求助】关于单负链病毒RNA提取及逆转录的问题

        丁香园论坛

        3556
        我最近正在做单负链RNA病毒(狂犬病毒)的rna提取,逆转录及目的基因的扩增,可是结果是 目的基因没有出现,引物是在比对后在保守处设计的,但是产物除了引物条带和一非特异条带(30个循环,不是很亮)外,再无其它条带,尝试提高退火温度 但是结果仍不好,合成cDNA的时候,使用的是以ATG(应该是上游引物吧)开头的引物。我不知道哪里出错了,希望能得到大家的建议。
        目的条带大概在1500bp附近,P出来的条带在500~750之间,最下面的为引物带,
        提取的RNA跑过胶吗?图放上来看看。
        建议:1、使用随机引物做逆转录,这样的话更好扩一些。
        2、PCR的时候试用LA-taq看看。因为1500BP其实也不短了。
        3、摸好PCR的反应条件,实在不行,分段扩增。
        大鹏鸟 wrote:
        提取的RNA跑过胶吗?图放上来看看。
        建议:1、使用随机引物做逆转录,这样的话更好扩一些。
        2、PCR的时候试用LA-taq看看。因为1500BP其实也不短了。
        3、摸好PCR的反应条件,实在不行,分段扩增。
        谢谢!提取过三次RNA但是只有前两次跑过胶,因为知道没有RNA并不意味着没有RNA产物。下面是我前两次跑的RNA。





        对于PCR条件的摸索,我之前用55°退火,会出现之前的发的条带,用58°退火也如此,提高到60°时 就没有条带了,如下图:
        第一孔为不佳模板对照,第二孔为用cDNA进行PCR

        而我不加模板PCR时,有时会出现跟模板一样的条带,如下:

        第二个孔为不加模板PCR结果。那么我现在怀疑,难道我一直以来P出来的很淡的特异性条带根本就是引物之间发生结合的结果么?因为之前别人设计过一对引物也会出现这样的情况,所以我很郁闷。
        您好,请问我抽的病毒RNA跑胶没有条带,您抽的RNA跑胶是有条带的是吗?

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