逆转录病毒载体介导法

2.将10μg含抗药基因的逆转录病毒质粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32μL 2mol/LCaCL₂,轻振动，加盖30分钟，室温下培养45分钟，直到小的、模糊的兰色沉淀产生。

3. 从包装细胞中弃去旧液，轻轻滴入HeBs-DNA沉淀于细胞培养皿中心，使细胞接触DNA20分钟，每10分钟轻轻摇动培养皿，使溶液均匀，加入10mL培养液，并于37℃放置4小时。

4. 完全吸出培养液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培养箱继续培养，如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包装细胞系，需培养3.5分钟，若为Q2bn包装细胞系，需培养1.5分钟，或根据不同包装细胞选用不同时间。迅速弃去HeBs/甘油，用10mL培养液洗2次，加入含有血清的5ml培养液培养18——24小时。

5. 取出培养液用0.45μm过滤，可获得含有短期产生病毒的培养上清，-70℃或-80℃贮存，或立即用于其它包装细胞系的感染。

6. 加入10ml培养液于上述已感染的细胞，继续培养2——3天，继续步骤10。

7. 另一包装细胞受感染前1:10或1:20传代。8.倒去包装细胞的培养液，加入步骤5获得的病毒。方法如下：

对于10cm培养皿，将0.1至1.0mL病毒贮存液稀释至3——5mL的终体积，加入800mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L，培养1小时以上。

9. 若10cm培养皿加入10mL培养液，6mL培养皿中应加入4mL培养液，培养2——3天。

10. 步骤6或步骤9得到的感染细胞，2——3天后按1:10或1:20传代，接种于选择培养液培养3天，更换培养液，继续培养3——4天，直至克隆出现。

11. 用克隆环挑出分离的克隆，每个克隆接种24孔板或6孔板中的二个孔，生长至50——90%底部面积。

12. 倒去培养液，换入1倍体积的培养液，继续培养1——3天，收取培养液，马上滴定，或者贮存于-70℃或-80℃。

13. 继续传代克隆细胞直到能被冷冻或被鉴定，若病毒产生克隆被鉴定，10%——15%DMSO保护剂液氮冻存细胞。即产生病毒细胞系建立。

1. 无论用什么方法将DNA导入细胞，暂时或稳定的转染率很大程度取决于细胞的类型。不同的细胞系对获取外源性DNA以及表达的能力相差几个数量级。此外，一种方法对一种培养细胞有效，但对另一种培养细胞可能无效。

2. 合适的载体将外源基因高效导入受体靶细胞，需要按照操作步骤在专门的实验室中安全进行，防止原生物种基因库非预期或不受控制的基因六点，导致基因污染。

1. 基因治疗载体主要分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染效率高，靶向性强，但其包装能力小，易引起免疫反应。非病毒载体毒性低，具有低免疫原性，但转染效率低。

2. 病毒对宿主细胞的免疫反应制约着病毒载体的发展，需要构建出更合适的重组病毒载体，在低免疫原性的条件下仍有较高的基因介导效率。而对于非病毒载体，载体材料的选取是影响靶基因导入效率的关键。