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        【求助】请教TOPflash检测

        丁香园论坛

        14859
        本人近日做TOPflash实验检测wnt通路的激活情况,遇到些许问题,希望做过TOPflash assay或了解wnt通路的战友解疑答惑。
        1、看了些相关文献,既有分别转染TOPflash和FOPflash,结果用TOP/FOP值来表示的;也有只转染TOPflash,然后就用TOP值来表示的。不知这是什么原因,在什么情况下不用FOP? 我因为刚刚接触,用的是分别转染TOPflash和FOPflash,但遇到了问题。
        2、FOPflash值不稳定,并不像有些文献里的那样,各组之间FOP值都不变,我的有时变化2-3倍。而且FOP值很高,同样量的TOP和FOP,FOP值远高于TOP,除非激活剂强刺激才使TOP/FOP值达到个位数。
        3、有个基因,做了几次,发现TOP值没怎么升高,而FOP值降的挺厉害,导致TOP/FOP值升高,这能说明通路激活了吗?

        请有经验的战友示下。
        就没有一个人做过? 自己顶起来!
        关注中,顶起
        Top和Fop序列基本上一致的,Top的荧光素酶启动子上有几个Lef/TCF的结合位点,而在FOp是突变的,因此Top/Fop可以检测Wnt的活性改变。
        1.应该是要用Top/FOP值来表示结果,Fop值当作一个背景值。
        2.Fop是比较稳定的,特别是在组内。不过你说“各组之间”,有可能不同处理会有影响,不过应该不影响结果分析。一般Top会比Fop高或相似,除非你的处理是抑制Wnt通路的。
        3.如果Fop值有降低,应该不是Wnt通路的改变引起的。Top和Fop除了Wnt的反应元件不同,其余都一样,如果Fop有下降,Top也应该会下降。

        你的Top、Fop质粒是否标记反了,或治疗哪里有突变?
        另外在转染是要共转染另外一种荧光素酶,如pRL-TK作内参。
        请问LZ具体怎么做的呀?有没有详细的步骤呀
        楼主说说具体步骤吧,我也想了解下,看看实验中能否用到
        实验室菜鸟,同求流程与步骤。谢谢
        楼主用的是什么检测试剂啊?能用Dual-Luciferase ® Reporter Assay来检测吗?求回复
        奔奔0808 wrote:
        楼主用的是什么检测试剂啊?能用Dual-Luciferase ® Reporter Assay来检测吗?求回复
        请问是用这个试剂来检测吗?最近我也要做这个实验
        我们实验室用过Topflash和FopFlash,就是用promega公司的
        ??
        Dual-Luciferase ® Reporter Assay试剂盒检测的。

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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