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        方案3 蛋白质还原和S-羧甲基化:微量方法

        相关实验:电泳分离的蛋白质肽谱和序列分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、样品还原

        1.利用冷冻干燥离心机蒸发纯化的蛋白质样品溶液(含 0.01%~0.02% Tween-20),直到少于 10ul。

        2.加入 150ul 储存液到含有近乎干燥的蛋白质样品的离心管中,轻轻弹击或振荡离心管,使样品彻底混匀,然后略微离心样品。

        3.加人 16ul 还原缓冲液,使 DTT 的终浓度为 15 mmol/L。

        4.样品在 40°C 孵育 4.5~5 h。

        二、样品烷基化

        5.还原过的蛋白质样品溶液置于室温。

        6.加入 20ul 0.5mol/L 碘乙酸,至碘乙酸的终浓度为0.05mol/L。

        7.25°C 避光反应 30 min。

        三、S-羧甲基化蛋白质的回收(脱盐和浓缩)

        8.将 2%~3%(约 300ng 蛋白质)的总混合物上样到反相微孔层析柱中(50 mm X 1mm 内径 HPLC 系统)。

        在加人大量的蛋白质至 RP-HPLC 之前,用 2%~3% 的总样品(约 300ng) 做预实验,以确定样品能够从反相柱上回收。这个脱盐的预实验极为重要,因为一些蛋白质在 S-羧甲基化后会有不同的层析结果(比如,它们比天然的蛋白质更加疏水)。如果 S-羧甲基化蛋白的疏水性比天然蛋白质的疏水性高得多,用 TFA/乙腈溶剂系统就很难从反相柱上回收蛋白质。这时可试用正丙醇代替乙腈,如果仍不行,试着用微尺寸排阻层析或快速微型脱盐系统对 S-羧甲基化蛋白进行脱盐。

        9.一旦确定 S-竣甲基化蛋白质能够从反相柱上回收,即可加人剩余的蛋白质样品。

        10.至于 Tween-20 调节含有 S-竣甲基化蛋白的部分(一般在 300~500ul 0.1% TFA 水溶液/乙腈中),至终浓度为0.2 g/L。关于收集到的 S-羧甲基化蛋白的酶解消化,见方案 5。

        来源:丁香实验

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