植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析

一、目的

掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。

二、原理

十六烷基三乙基溴化胺是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。

三、试剂与器材

（一）、试剂

1 、DNA extraction ：500ml
31.885g sorbitol (山梨醇)
6.05g tris PH8.2 (一般不调)

2、Nuclei lysis buffer: 500ml
100ml 1M Tris PH7.5
100ml 0.25M EDTA
200ml 5M NaCl
10g CTAB
100ml ddH2 O

3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml
用时，将上述三种溶液按1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l），65℃预热，既为抽提液。

（二）器材

恒温水浴、研钵、电泳设备

四、操作步骤

（一）、基因组 DNA 提取

1 取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700ml抽体液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。

2 取出裂解好的DNA ，加入700ml氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（1000rpm，10分钟）。

3 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放半小时以上。

4 将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。

5 去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，离心 干燥，溶于50ml ddH2O。

（二）、酶切及电泳分析

1.取四支1.5ml离心管，分别写上标记：g/EcoRⅠ、g/HindⅢ、λ/EcoRⅠ和λ/ Hind Ⅲ。

2.前两支试管加入30 ml基因组DNA。后两支试管加入3mlλ基因组DNA。

3.前两支加入5 ml 10×buffer。后两支加入2ml 10×buffer。

4.前两支分别加入ddH2O 12.5ml，后两支分别加入ddH2 O 13.

5.分别加入RNase 1 ml。

6.前两支试管分别加入1.5 ml EcoRⅠ和Hind Ⅲ，10000rpm离心20 S混匀。前两支试管分别加入1 ml EcoRⅠ和Hind Ⅲ，10000rpm离心20 S混匀。
7.37℃反应4h

8.0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。

9.观察记录并分析实验结果。