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        血基因组DNA 试剂盒提取法

        相关实验:血基因组 DNA 提取实验

        最新修订时间:

        原理

        采用特殊的细胞裂解和蛋白去除液(包括蛋白酶K 裂解)从抗凝全血中得到基因组DNA。

        材料与仪器

        步骤

        一、试剂盒组成、贮存、稳定性
         
        1.  说明书,耗材:96孔深孔板(1.6 ml),96圆孔板,96孔DNA制备板,96圆孔硅胶片,BF-400膜。
         
        2.  Proteinase K:冻干的蛋白酶K 可室温贮存6 个月,长时间保存请置于4℃;溶解后,在2-8℃可贮存2 个月,长时间保存请勿置于室温中。
         
        3.  Buffer PK :蛋白酶K 溶解液,室温密闭贮存。
         
        4.  Buffer BL :细胞裂解液,室温密闭贮存。
         
        5.  Buffer W1B concentrate :洗涤液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
         
        6.  Buffer W2 concentrate :去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
         
        7.  10xBuffer W2(12x96 试剂盒):用于配制Buffer W2 。
         
        8.  Eluent B:7.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,0.3 mM EDTA ,室温密闭贮存。
         
        二、实验准备
         
        1.  第一次使用时,在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
         
        2.  Buffer W2(12x96 试剂盒)配制:在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10xBuffer W2,135 ml 去离子水和350 ml 乙醇,可用100%无水乙醇或95%乙醇。
         
        3. 根据瓶上标签将蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中,请勿旋涡振荡。
         
        4. 准备70℃温浴。
         
        5. 使用前检查Buffer BL 是否有沉淀析出,若出现沉淀,请于70℃温浴加热至沉淀完全溶解后再使用。
         
        三、操作步骤
         
        1.  向96 圆孔板的每孔中加入20 ul 蛋白酶K。
         
        2.  加200 ul 抗凝全血到96 圆孔板中。
         
        ~undefined 若全血样品体积少于200 ul,用PBS 补充到200 ul。
        ~undefined 若样品为鸟类血,样品用量须低于10 ul。
        ~undefined 若需得到RNA-free 的基因组DNA,在步骤3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。
         
        3.  加200 ul Buffer BL ,注意不要打湿每孔的边缘,用96 圆孔硅胶片密封各孔。
         
        4.  用力混合30 s。
         
        5. 3000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3000rpm后即停止。
         
        6. 在培养箱或烘箱中70℃温浴至少10 min。
         
        7.  3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3 000rpm后即停止。
         
        8. 取下96 圆孔硅胶片,每孔加入200 ul 乙醇(96-100%)。
         
        9.  用96 圆孔硅胶片密封各孔,用力混匀混合15 s。3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到圆孔板内。启动离心机,当速度达到3 000 rpm 后即停止。
         
        10.  将96 孔DNA 板放到一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圆孔板上的96 圆孔硅胶片,将每孔中的溶液转移至96 孔DNA 板 中,6 000 rpm 离心4 min。
         
        11.  丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液,将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入500 ul Buffer W1B,用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板,6 000 rpm 离心4 min。
         
        ~undefined 确认在Buffer W1B concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
         
        12.  丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液,将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入850 ul Buffer W2,用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板,6 000 rpm 离心4 min。
         
        ~undefined 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
         
        13.  弃滤液,将96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入400 ul Buffer W2, 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板,6 000 rpm 离心4 min。
         
        14.  将96孔DNA板放在一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上,用BF-400膜密封96孔DNA板,6 000 rpm离心15 min。
         
        15.  将96孔DNA板放在另一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入100-200 ul Eluent B 或去离子水,室温静置2 min,用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板,6 000 rpm 离心4min洗脱得到DNA。
         

        注意事项

         1.  Buffer BL 和Buffer W1B 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水和生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。

        来源:丁香实验

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