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        甲醇酵母表达常用溶液及缓冲液的配制

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        8522

        1.毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制

        1.1 各种母液的配制

        1undefinedYNB:(含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基) 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)+100g硫酸铵,溶于1000ml水中,过滤除菌。

        50undefinedB:(0.02%生物素 Biotin) 4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中,过滤除菌。

        10undefinedH:(0.4%Histidine 组氨酸) 4℃保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中,(加热至50℃以促进溶解),过滤除菌。

        1undefinedD:(20%Dextrose 葡萄糖)保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中,灭菌15min或过滤除菌。

        1undefinedM:(5%Methanol 甲醇) 保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀,过滤除菌。

        1undefinedGY:(10%Glycerol 甘油) 保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。

        10undefinedAA:(0.5% of each Amino Acid,各种氨基酸) 4℃保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中,过滤除菌。

        1M 磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer,pH6.0),将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀,其pH为6.0,如需调节pH,则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。

        1.2 常用溶液及缓冲夜

        1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液:

        溶液Ⅰ:50mmol / L glucose,100mmol / L EDTA,25mmol / L Tris-HCI (pH 8.0)

        溶液Ⅱ:0.2mol/L NaOH,1% SDS(临用时配制)

        溶液Ⅲ:29.44g KAc,11.5ml Acetic acid,加ddH2O至100 ml。

        4℃保存。

        1.2.2 10% 甘油 (Glycerol):

        将100ml甘油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。保存期为1年以上。

        1.2.3 Rnase-H2O:

        1ul Rnase 加入1ml 灭菌 dd H2O。4℃保存。


        1.2.4  TE缓冲液:

        10mmol / Tris-CI(pH 8.0), lmmol / L  EDTA(pH 8.0)

        1.2.5  STE缓冲液:

        0.1mol / L,  10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)

        1.2.6  SCE缓冲液:

        1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠 , 10mmol / L EDTA

        1.2.7  1M potassium phosphate buffer (pH 6.0):

        132 ml 1M  K2HPO4

        868 ml 1M  KH2PO4

        1.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液,pH 8.0(1L):

        242 g   Tris

        57.1 ml   Acetic Acid

        37.2 g   EDTA

        2.毕赤酵母表达的培养基配制

        2.1 LB(Luria-Bertani)培养基:  

        Trypton        l%

        Yeast Extract   0.5%

        NaCl          l%

        PH 7.0

        制作平板时加入 2%琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。

        2.2 LLB(Low Salt LB)培养基:  

        Trypton        l%

        Yeast Extract   0.5%

        NaCl        0.5%

        PH 7.0

        制作平板时加入 2%琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时,加入Zeocin 25ug / ml,可以4℃条件下保存1~2周。


        2.3 YPD (又称YEPD)

        Yeast Extract Peptone Dextrose Medium,(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium,酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基)

        Trypton               2%

        dextrose (glucose)    2%

        +agar                 2%

        +Zeocin              100 μg/ml

        液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml,成为YPDZ培养基,可以4℃条件下保存1~2周。

        2.4 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium):

        yeast extract         1%

        peptone               2%

        dextrose (glucose)    2%

        sorbitol              1 M

        +agar                 2%

        + Zeocin              100 μg/ml

        不管是液体YPDS培养基,还是YPDS + Zeocin 培养基,都必须存放4℃条件下,有效期1~2周。

        2.5 MGY

        Minimal Glycerol Medium (最小甘油培养基)

        (34%YNB;1%甘油;undefined10-5%生物素)。将800ml灭菌水、100ml的1undefinedYNB母液、2ml的50undefinedB母液和100ml的1undefinedGY母液混匀即可,4℃保存,保存期为2个月。

        2.6 MGYH

        Minimal Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸)

        在1000ml的MGY培养基中加入10ml的10undefinedH母液混匀,4℃保存,保存期为2个月。


        2.7 RD

        Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培养基)

        (含有:1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;undefined10-5%生物素;0.005%氨基酸)

        1. 将186g的山梨醇定容至700ml,高压灭菌;

        2. 冷却后于45℃水浴;

        3. 将100ml的1undefinedD、100ml的1undefinedYNB;2ml的50undefinedB;10ml的10undefinedAA等母液和88ml

        无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。

        2.8 RDH

        Regeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸)

        在RD培养基配制的第三步中,在加入10ml的10undefinedH母液,同时无菌水的体积减少至78ml即可,其余配制方法与RD相同。4℃保存。

        2.9 RD及RDH平板的制备

        1.将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml,高压灭菌;冷却后于60℃水浴;

        2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4,将100ml的1undefinedD、100ml的1undefinedYNB;2ml的50undefinedB;10ml的10undefinedAA等母液、(10ml的10undefinedH母液)和88(78)ml无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀;

        3.迅速制备平板。4℃可保存数月。

        2.10  RD及RDH 的TOP 琼脂的制备(常用于酵母菌的包被)

        1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml,高压灭菌;冷却后于60℃水浴;

        2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4,将100ml的1undefinedD、100ml的1undefinedYNB;2ml的50undefinedB;10ml的10undefinedAA等母液、(10ml的10undefinedH母液)和88(78)ml无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀;

        3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温,备用。

        2.11 MD与MDH

        Minimal Dextrose Medium +(Histidine)  最小葡萄糖培养基 +( 0.004 %组氨酸)(含有:1.34%YNB;;undefined10-5% 生物素;2%葡萄糖)

        1.100ml的1undefinedYNB;2ml的50undefinedB和100ml1undefinedD母液,用800ml的无菌水定容至1000ml即可;

        2.如配制MDH,可在上述的MD中加入10ml的10undefinedH即可;

        3.如配制平板,可无菌水的灭菌前,加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。

        2.12  SOC培养基:

        Trypton               l%

        Yeast Extract         0.5%

        NaCl                  0.05%

        Glucose (1mol / L)     2%

        121℃高压灭菌 20min,冷却后,4℃保存

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