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        大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法

        互联网

        7139

        第一天:

        1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养

        2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用

        3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用

        第二天:

        4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升摇瓶

        5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时

        6. 定时监控OD600值(培养1小时后每半小时测定一次)

        7. 当OD600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)

        8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)

        9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。

        10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液

        11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞

        12. 离心,弃上清液

        13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞

        14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)

        15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml

        16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存

        转化方法:

        1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA,冰上培育约5分钟

        2. 添加1-3μl DNA,冰上培育约5分钟

        3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中

        4. 加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT

        5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd,2.5 千伏)(检查时间常数,应该在3以上)

        6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中

        7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原

        8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养

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