电转感受态大肠杆菌如何制备，电转流程是什么，其过程需要注意什么细节

制备电转感受态大肠杆菌步骤:

1.挑选一个大肠杆菌菌落，并将其接种在20mL LB培养基中，并在37°C振荡培养过夜。

2.以1％的接种量接种20mL LB培养基，并在37°C下以230 rpm的转速摇动3小时。

3.取1ml培养物，冰浴30分钟，在4℃以4,000 r / min离心3分钟，然后除去上清液。

4.加入500 ul冰冷的0.1 mol / L CaCl 2溶液，重悬细菌沉淀，在4℃以4,000 r / min的速度离心3分钟，然后除去上清液。

5.添加100ul体积的冰冷的0.1 mol / L CaCl 2溶液，重悬细菌沉淀，在4°C下以4,000 r / min离心4分钟，然后除去上清液。

6.50 ul体积的冰冷的0.1 mol / L CaCl 2溶液，将细菌沉淀重悬在冰浴中3 h-24 h，即大肠杆菌感受态细胞。

大肠杆菌感受态的制备注意事项，具体有以下几个方面：

第一、在整个实验操作的过程当中，所使用的试管、枪头、离心管、量液器等器皿及用具都要在无菌的条件下进行，要求在高压条件下灭菌处理；

第二、在实验过程中，注意所有应用的试剂、DNA酶都不能与其他的试剂相混淆，防止互相交叉感染，以免影响转化的效果；

第三、用于制备感受态细胞的菌液，最好是从零下20℃或零下70℃保存的菌液当中直接转接；

第四、不要用储存在4℃的培养菌液，或者已经多次转接、用过的培养菌液，要注意细胞的生长状态和密度。

以下是制备电转感受态大肠杆菌的步骤和注意事项：

1.步骤：

选择感受态大肠杆菌菌株。一般常用的感受态大肠杆菌菌株包括DH5α、TOP10、BL21等，其中DH5α是最常用的一种。

制备电转用菌种。将感受态大肠杆菌菌种在LB培养基上进行前处理，一般情况下需要生长至对数期，细胞浓度应控制在1×10^8 ~ 1×10^9 cfu/mL。菌种的生长条件可以根据菌株特性进行调整。

收获细胞。在对数期细胞中离心收获，用冷电解质缓冲液（如PBS）洗涤细胞2~3次，最后以PBS调节细胞密度至1×10^10 cfu/mL，备用。

制备DNA。根据需要制备目标DNA，可以采用PCR扩增、酶切、纯化等方法。

进行电转。将目标DNA与感受态大肠杆菌菌株共转化，常用的电转操作步骤包括以下几个方面：

预冷电击电极和电击缸

在冰上将转化混合物加入电击缸中

进行电击（一般为2000V，25uF，200Ω，25ms）

在加入1mL SOC培养基中恢复电转菌株

在LB固体培养基上进行分离筛选

2.注意事项：

选择合适的感受态大肠杆菌菌株，根据实验需要进行筛选。

菌株的处理和收获细胞的过程中，需要注意无菌操作，避免外源污染。

在进行电转操作前，要仔细调整电击电极和电击缸的温度，确保电极温度低于-70℃。

转化混合物的组成要严格控制，合理的浓度比例能够提高电转效率和转化成功率。

进行电击的时间和电压要准确掌握，避免对细胞造成不可逆损伤。

菌落分离和筛选过程中，要注意无菌操作，避免多个菌株交叉污染。可以在选择菌株时，根据菌落的形态、大小、颜色、透明度等特征进行判别和筛选，避免误选或漏选。

电转过程中需要用到的所有试剂、介质等物品都需要提前准备好，避免操作时出现断料或者延误时间等情况。

在转化后的菌落分离和筛选过程中，可以使用含有适当抗生素的LB固体培养基来筛选目标菌株，提高筛选的特异性和敏感性。

在进行电转操作时，需要注意安全问题，例如佩戴手套、口罩等防护用品，避免电击操作对人体造成危害。

电转态大肠杆菌制备流程：

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1．将大肠杆菌TG1种到基本培养琼脂板，37℃过夜。

2．将基本培养琼脂板上的大肠杆菌TGl再接种到含有15m1 2XTY培养基的100ml形瓶中。37℃振荡培养过夜。

3．用5ml夜培养的TGl接种到两个含500m1 2×Y培养基的2L有挡板锥形瓶中。在摇床中培养约1．5小时，直到A600接近0．5。

4．将菌液转移4个预冷离心瓶中(约250ml/瓶)。平衡后，置于冰上20分钟。

5．以3000g，4℃离心15分钟。使用前预冷所有转头。

6，弃去上清，并以起始体积的冰冷lmmol/L Hepes溶液(约250m1)重悬每个锥形瓶中的细胞。所有溶液都应当新鲜配置。

7．再次以3000g，4℃离心15分钟。

8．以一半起始体积的冰冷lmmol/L Hepes溶液(约125ml)重悬每个锥形瓶中的细胞；此时可合并到两个离心瓶中。

9．再次以3000g，4℃离心15分钟。

10．以总体积为20m1的10%甘油和lmm01/L Hepes混合液重悬所有细胞。

11．再次以3000g，4℃离心15分钟。

12．如果细胞不是新鲜使用而是储存，则需准备乙醇/干冰浴。

13．以总体积为2m1的10%甘油重悬细胞。

14．使用新鲜制备的细胞，或者用干冰浴等量分装冻存细胞②。在检测效率后，及时使用细胞(在1周内)。