【分享】Real-time PCR 引物设计

结合网上查阅的一些信息和TaKaRa使用说明书中的引物设计要求，同时结合文献上的论述，总结出Real-time PCR 引物设计的要求及设计步骤。首先向那些以前发布信息的朋友表示感谢！因为有些是引用你们的（由于引用的比较散，无法署名感谢）

1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman, Alignment 软件看看结果。

2.引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大。

3.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。

4.引物序列要求：A、T、C、G整体分布尽量均匀，不能有部分AT rich，GC rich（特别是3′），避开T/C（Polypyrimidine）或者A/G（Polypurine）的连续结构。

5 避开引物内部或者两条引物之间3个碱基以上的互补序列，两条引物间的3′避开有2个以上的互补序列。

6.特异性：是用BLAST检索确认引物的特异性。

7.引物5′端可以修饰。

8.两条引物的TM值不能相差太大。TM值的计算使用专用软管：OLIGO：63-68度； Primer3：60-65度

9.引物3′端最好为G或者C，3′尽量避免为T。

10.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。

11.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.

12.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。

13.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源

14.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。

我们的经验是根据以上要求，使用引物设计的软件Primer 5.0设计引物，当然不可能每一条都符合上述要求（我们构建一些载体时不是只能在编码序列前面加上酶切位点和保护碱基，不是别无选择吗？），从中选取较好的。至于能否用只有看你的运气了。

下面附上一点文献：“Gene-specific primer pairs for quantitative PCR were designed by using PRIMER3 software (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) and purchased from Qiagen (Valencia, CA). Hairpin stability and compatibility of these primers were also estimated by using OLIGO ANALYZER 3.0 (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). The PCR products were ≈150 bp in length and spanned the 3' regions of cDNA sequences. Quantitative PCR was performed in 20-μl reactions containing 5 μl of 50-fold diluted first-strand cDNA (1 μl of sample contains the first-strand cDNA obtained from 2 ng of total RNA), 0.3 μM each primer, and 1× QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). The following PCR program was used in the Applied Biosystems PRISM 7700 Sequence Detection System: 50°C for 2 min, 95°C for 10 min, then 40 cycles of 95°C for 15 s, 60°C for 1 min, and 72°C for 1 min. Primer efficiencies were measured and relative expression level was calculated by using the comparative CT method (User Bulletin 2 for ABI Prism 7700 Sequence Detection System). 2–ΔΔC T of wild type without Pi starvation (0 h) was normalized to 1. ”